Purificação e Agregação do Domínio proteína precursora de amilóide intracelular

O objetivo deste procedimento é purificar o domínio intracelular da proteína precursora de amiloide, também conhecido como A ICD, e apresentar um protocolo para agregação térmica e caracterização do A ICD por microscopia de força atômica. Isso é realizado primeiramente pela expressão de uma fusão A GST do A ICD em bactérias. Em seguida, a proteína G-S-T-A-I-C-D é purificada, clivada com trombina para separar a GST do A ICD, e a GST é removida.

Em seguida, induz-se a agregação térmica do A ICD. Por fim, os agregados de A ICD são visualizados utilizando microscopia de força atômica. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram que o A ICD pode ser purificado até a homogeneidade em quantidade suficiente para análises bioquímicas e biofísicas.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, que exigem etapas complexas de cromatografia, é que uma ICD altamente pura e solúvel pode ser isolada em bancada utilizando reagentes e equipamentos padrão. Uma ICD produzida por este protocolo é adequada para caracterização bioquímica e biofísica adicional.

Quem demonstrará o procedimento será Amina ti. O Dr. Andres Oberer, ex-pós-doutorando do meu laboratório, demonstrará como realizar a imagem de microscopia de força atômica do domínio intracelular de A, ou A ICD. Para expressar o domínio intracelular recombinante de A PP, ou A ICD, comece com células BL21 transformadas com o vetor pgx 41, contendo o A ICD humano fundido à extremidade C do GST. Inocule uma única colônia em 10 mililitros de caldo LB com ampicilina e incube durante a noite a 37 graus Celsius com agitação vigorosa. Na manhã seguinte.

Incube 400 mililitros de LB com ampicilina em um frasco de um litro com cinco mililitros da cultura de crescimento noturno. Incube a 37 graus Celsius com agitação vigorosa até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja entre 0,4 e 0,6. Isso normalmente levará de duas a 2,5 horas para induzir a expressão de G-S-T-A-I-C-D.

Estamos adicionando 0,4 milimolar de IPTG e incubando a 37 graus Celsius com agitação vigorosa por cinco horas. Centrifugue as células a 6.000 × g durante 15 minutos a quatro graus Celsius e armazene o pellet a menos 80 graus Celsius. Após preparar o tampão de lise e colocar as bactérias no gelo, adicione 20 mililitros de tampão ao pellet e, usando uma combinação de vortex e pipetagem no gelo, homogeneíze completamente.

Resuspenda o pellet bacteriano. Passe o lisado bacteriano suspenso de Reese através de um emulsificador pré-resfriado ou prensa francesa. A 30.000 PSI, passe o lisado pelo emulsificador uma segunda vez e colete o lisado em um tubo de 50 mililitros pré-resfriado. Centrifugue o lisado a 15.000 × g e 4 °C por 30 minutos.

Se pare e transfira o sobrenadante para um tubo de 50 mililitros previamente resfriado. Adicione 500 microlitros de uma suspensão a 50% de glutationa ligada a agarose. Incube em rotação durante 30 minutos a quatro graus Celsius enquanto a amostra gira.

Prepare o tampão de eluição fresco após a incubação. Despeje o lisado e a suspensão em uma coluna descartável de cromatografia de poliestireno de cinco polegadas com filtros grossos. Lave a coluna cinco vezes com três mililitros de PBS.

Tampe a parte inferior da coluna e adicione 500 microlitros de tampão de eluição à temperatura ambiente. Tampe a parte superior da coluna e gire por cinco minutos à temperatura ambiente. Colete o eluato inicial em um tubo microcêntrifugo de 1,5 mililitro resfriado.

Repita a eluição mais duas vezes. Dialise o eluato em uma membrana de diálise com corte de peso molecular de 10.000 em quatro litros de PBS durante a noite, a quatro graus Celsius, no dia seguinte. Dialise contra mais quatro litros de PBS a quatro graus Celsius por uma hora.

Remova a proteína do cassete de diálise e realize um ensaio de quantificação proteica para determinar o rendimento da G-S-T-A-I-C-D. Uma purificação típica a partir de 400 mililitros de cultura resultará em rendimentos superiores a 20 miligramas de proteína purificada, com concentrações entre 10 e 20 miligramas por mililitro. Aliquote a proteína em alíquotas de 200 microlitros e congele a menos 80 graus Celsius.

Para liberar o A ICD do GST fundido, adicione 200 microlitros de G-S-T-A-I-C-D purificado e 20 microlitros de trombina com concentração de uma unidade por microlitro, incubando a mistura durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, remova qualquer material agregado por centrifugação a 20.000 ×g durante 30 minutos a 4 graus Celsius. Transfira o sobrenadante para um tubo microprévio previamente resfriado para remover o GST e a trombina. Adicione, respectivamente, 50 microlitros de suspensão de glutationa a 50% e 50 microlitros de suspensão de winozaina a 50%.

Incube com rotação por cinco minutos em temperatura ambiente. Centrifugue brevemente para sedimentar as esferas de agro e remova o sobrenadante para um tubo novo. Extraia a GST mais quatro vezes com glutationa.

Aros realiza um ensaio de quantificação proteica em cinco microlitros do A ICD purificado. Rendimentos típicos obtidos a partir de um cultivo de 400 mililitros são de 50 a 100 microgramas, numa concentração de 0,2 a 0,5 miligrama por mililitro. Após diluir o A ICD recém-preparado em PBS até uma concentração de 0,1 miligrama por mililitro, induziu-se a agregação térmica incubando as amostras a 43 graus Celsius, a 800 RPM, em um agitador aquecido durante 48 horas.

Realize uma diluição 20 vezes do amostra com água desionizada e aplique dois microlitros sobre mica recém-clivada. Seque a amostra em um dessecador durante a noite para visualizar os agregados de A ICD utilizando microscopia de força atômica no modo tapping com microcantileveres de nitreto de silício revestidos a ouro e raio da ponta nominal de dois nanômetros.

Amplitudes típicas de batida durante a imagem, de 10 a 20 nanômetros na frequência de ressonância das alavancas. A expressão e o enriquecimento relativo de G-S-T-A-I-C-D são mostrados aqui. Após a lise, a maior parte da proteína de fusão está presente na fração solúvel e, portanto, não é necessária a extração a partir de corpos de inclusão.

O material eluído da coluna de glutationa é maior que 95% puro. Na preparação mostrada aqui, a concentração da proteína eluída da coluna foi de 14,5 miligramas por mililitro, e o rendimento foi de 22 miligramas. A clivagem de 200 microlitros dessa preparação durante a noite com 20 unidades de trombina resultou em quase 100% de clivagem da proteína de fusão.

A quantidade de trombina utilizada é baixa o suficiente para não ser detectável pelo kumasi. A coloração azul e a remoção da trombina e da GST resultaram em alguma perda de material. No entanto, a pureza foi superior a 90%, com um rendimento nesta preparação de 70 microgramas de A ICD numa concentração de 0,35 miligramas por mililitro.

Um ICD agregado, visualizado por MF, é tipicamente amorfo esteroide e varia em tamanho entre 50 e 100 nanômetros. O material agregado não é detectável quando uma quantidade equimolar da chaperona UBI Quillin um é adicionada à reação de agregação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como purificar o EICD, induzir sua agregação e imagens de agregado por A-F-M-E-I-C-D.

Podem ser aplicados com essa técnica outros métodos, como espalhamento de luz e ensaios de retenção em filtro, para responder perguntas sobre o efeito das chaperonas moleculares na agregação de EACD.