Diferenciando papéis funcionais da expressão do gene de células imunes e não-imunes na colite Rato por Transplante de Medula Óssea

O objetivo geral do experimento demonstrado neste vídeo é avaliar se o peptídeo antimicrobiano lyin desempenha um papel na melhora da colite induzida por sulfato de dextrana em camundongos. Isso é realizado injetando medula óssea de camundongos selvagens em camundongos licit e knockout irradiados e medula óssea de camundongos knockout em camundongos selvagens irradiados. A medula óssea transplantada irá gerar novas células sanguíneas no receptor, de acordo com o genótipo do doador.

Os camundongos receptores são então expostos ao sulfato de dextrana para induzir colite após quatro semanas. O transplante bem-sucedido é validado por citometria de fluxo e os danos no tecido colônico são avaliados por histologia. São obtidos resultados que mostram que a colite é atenuada quando medula óssea de tipo selvagem é transplantada em camundongos knockout.

Por outro lado, a colite é agravada quando medula óssea de camundongos knockout é transplantada em camundongos selvagens. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na determinação das expressões gênicas de células derivadas da medula óssea ou de células não derivadas da medula óssea em processos inflamatórios ou infecciosos. Camundongos C 57, black six, selvagens e camundongos knockout C elicited são recomendados para este experimento, a fim de possibilitar o rastreamento dos camundongos selvagens e dos camundongos knockout.

Células doadoras após transplante de medula óssea. Utilize camundongos CD 45.1 para representar camundongos selvagens e CD 45.2 para os camundongos knockout. O gráfico mostrado aqui descreve a configuração experimental: cinco camundongos doadores e 10 camundongos receptores são designados para cada grupo.

Para os grupos A e B, a medula óssea será transplantada de camundongos selvagens para camundongos knockout. A colite será induzida no grupo A, mas não no grupo B. Para os grupos C e D, a medula óssea será transplantada de camundongos knockout para camundongos selvagens, e a colite será induzida apenas no grupo C. Para os grupos E e F, o transplante será de selvagem para selvagem, e para os grupos G e H, o transplante será de knockout para knockout. Para preparar a medula óssea doadora para transferência para camundongos irradiados, comece por extrair a medula óssea dos ossos de camundongos sacrificados em uma cabine de segurança biológica.

Utilize instrumentos de dissecação estéreis para expor os ossos do úmero, fêmur, tíbia e fíbula livres dos músculos e ligamentos anexos e transfira-os para uma placa de Petri. Corte as duas extremidades dos ossos para mostrar a medula óssea vermelha. Em seguida, segure um dos ossos com pinça.

Lave a medula óssea vermelha com PBS frio utilizando uma seringa de três mililitros e agulhas de 25 graus em outro recipiente de Petri. Em seguida, lave o osso pela outra extremidade para obter mais células da medula óssea. Repita este processo com cada um dos ossos.

Reúna separadamente a medula óssea de camundongos selvagens e de camundongos knockout. Use uma seringa de seis mililitros com uma agulha de 18 polegadas e meia polegada para quebrar os coágulos de medula óssea vermelha por aspiração e ejeção repetidas. Em seguida, use uma pipeta serológica para transferir a medula óssea coletada para um tubo cônico de 50 mililitros.

Após a transferência de toda a medula óssea, centrifugue a medula óssea a 740 G durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda o pellet por vortex por cinco a 10 segundos. Ao pellet, adicione cinco mililitros de tampão de lise de XRBC por camundongo doador, vortex novamente por cinco segundos e incube exatamente por três minutos à temperatura ambiente.

Após três minutos, adicione 20 mililitros de PBS frio a cada tubo e misture por inversão para interromper a lise. Em seguida, despeje o conteúdo através de uma peneira celular de 40 micrômetros em um novo tubo cônico de 50 mililitros. Enxágue o tubo original com cinco mililitros de PBS e transfira a solução para a peneira celular.

Continue coletando o fluxo passante no tubo cônico. Em seguida, complete o volume até 50 mililitros com PBS e misture por inversão. A seguir, determine a contagem de células viáveis pelo método de exclusão de azul de tripan usando um hemocitômetro.

Uma vez determinada a contagem celular, centrifugue as células da medula óssea a 913 × g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenadante com base na contagem total de células. Resuspenda o pellet em PBS a uma concentração de um vezes 10 à oitava potência de células por mililitro.

As células da medula óssea estão agora prontas para serem transferidas para camundongos receptores irradiados. Os camundongos receptores do tipo selvagem e knockout para este experimento foram irradiados com 1000 rad conforme descrito no documento complementar; os animais são criados e mantidos em uma instalação livre de patógenos. De quatro a vinte e quatro horas após a irradiação, aqueça os camundongos receptores em uma placa aquecedora sob uma lâmpada de aquecimento para injetar a medula óssea doadora. Coloque um camundongo receptor no dispositivo de contenção, limpe a cauda com etanol 70% para esterilizar o local da injeção e promover vasodilatação local, facilitando a injeção.

Usando uma seringa de insulina com agulha de 28 e meia polegadas, injete uma vez 10 à sétima potência de células em um volume de 200 microlitros na veia da cauda de cada camundongo após a injeção. Coloque o camundongo em uma gaiola com até outros três camundongos injetados durante as primeiras quatro semanas após a injeção. Mantenha os camundongos receptores injetados em gaiolas autoclavadas com água contendo o antibiótico sulfa trim.

Isso permite tempo para que os animais recuperem a imunidade, troquem as gaiolas e recebam água e alimento tratados com antibióticos a cada quatro dias para manter a higiene. Quatro semanas após a irradiação e o transplante de medula óssea, mude para água comum sem antibióticos e mantenha os camundongos por mais duas semanas para que recuperem sua microbiota intestinal normal. Seis semanas após a injeção de medula óssea, meça o peso corporal inicial para induzir a colite.

Administre aos camundongos do grupo experimental de colite 5% de sulfato de dextrana na água de beber. Cinco dias depois, reúna o sangue periférico de quatro camundongos em tubos vacutainer revestidos com heparina e coloque-os no gelo. Em seguida, em um tubo microcentrífugo de 1,5 mililitro, combine 300 microlitros de sangue com 300 microlitros de tampão para coloração celular e alíquotas do sangue em cinco tubos de citometria de fluxo rotulados de um a cinco, cada um com 100 microlitros, mantidos no gelo.

Após sacrificar os camundongos, meça novamente o peso corporal e calcule a alteração. Disseque os tecidos do cólon e coloque-os em formalina para coloração com h e d. Em seguida, obtenha as células da medula óssea como anteriormente.

Divida a medula óssea re-suspensa em cinco tubos de microcentrífuga rotulados de um a cinco, cada um com 100 mililitros. Em preparação para análise por citometria de fluxo, prepare a mistura de anticorpos para cada tubo respectivo no escuro, conforme descrito no documento anexo; amostras de sangue e medula óssea rotuladas com o número um servirão como controles e não serão coradas. Amostras de sangue e medula óssea rotuladas com o número dois serão coradas com controle de isotipos FITC, controle de isotipos PE e solução bloqueadora CD16/32.

Esses controles de isotipo são usados para confirmar a especificidade da ligação do anticorpo primário às amostras. A amostra marcada com o número três será corada com FZ CD 45.1 e CD 16/32. As amostras com solução bloqueadora marcadas com o número quatro serão coradas com CD 45.2 e CD 16/32.

Solução de bloqueio. A marcação com uma única cor pode revelar a presença de células de doador ou de receptor no sangue ou na medula óssea. Claramente, as amostras numeradas como cinco serão coradas para CD 45.1, CD 45.2 e CD 16/32.

O bloqueio aqui permite que a marcação com dupla cor mostre a proporção relativa de células doadoras e receptoras no sangue ou na medula óssea. Adicione cinco microlitros da mistura de anticorpos dois e cinco aos respectivos tubos de amostra. Em seguida, adicione três microlitros da mistura de anticorpos três e quatro aos respectivos tubos de amostra.

Incube todos os tubos no gelo por 30 minutos. Após a incubação, adicione dois mililitros de tampão de lise XRBC a cada tubo. Em seguida, incube as amostras por mais 15 minutos no gelo, no escuro.

Centrifugue as células a 350 vezes G, durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, remova o sobrenatante e ressuspenda o pellet com 500 microlitros de tampão de marcação celular no escuro. Em seguida, vortex brevemente.

Em seguida, realize citometria de fluxo nas amostras de sangue e medula óssea imunomarcadas. Selecione FZ para representar o tipo selvagem CD 45.1 e PE para representar o knockout CD 45.2. Analise os resultados da citometria de fluxo utilizando o software do Flo Joe.

Calcule a razão de fit E para razão PE ou razão PE para fit e para determinar se o genótipo do doador é genótipo dominante no sangue e na medula óssea. Esta imagem mostra imagens de h e e de cólons com histologia normal e colite DSS. As imagens de histologia são pontuadas com base no dano do tecido mucoso e na infiltração de neutrófilos nos tecidos mucosos e submucosos.

Assim, um escore histológico mais alto indica colite mais grave, para testar se a lyin desempenha um papel na prevenção da colite. A medula óssea foi trocada entre camundongos selvagens e camundongos knockout conforme descrito neste vídeo. A histologia foi então avaliada e pontuada como mostrado aqui.

Os escores de histologia aumentaram significativamente quando a medula óssea de camundongos knockout foi introduzida em camundongos selvagens irradiados. Inversamente, os escores diminuíram significativamente quando a medula óssea selvagem foi introduzida em camundongos knockout. Esses dados indicam que a proteína C endógena proveniente de células derivadas da medula óssea possui efeitos anti-inflamatórios e atenua a colite, confirmando que o transplante foi bem-sucedido nesses camundongos.

A citometria de fluxo também foi realizada na medula óssea e no sangue dos camundongos após o transplante. A medula óssea do tipo selvagem cora fortemente para Fitz CD 45.1, mas não para pe, CD 45.2, como mostrado aqui; a medula óssea de camundongos knockout cora fortemente para PE, mas não para Fitz, como mostrado aqui. Após o transplante, no entanto, tanto a medula óssea quanto o sangue de camundongos do tipo selvagem que receberam medula óssea knockout coraram fortemente para PE, mas não para Fitz, indicando que a população predominante de células coradas era proveniente do doador.

Da mesma forma, a medula óssea e o sangue de camundongos knockout que receberam medula óssea selvagem apresentaram forte coloração para fitzy, mas não para pe, confirmando novamente que as populações predominantemente coradas eram de origem doadora. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de realizar um experimento de transplante de medula óssea e deverá ser capaz de modificar a colite por meio de células derivadas da medula óssea.