Isolamento, purificação e Rotulagem de neutrófilos da medula óssea do rato de Estudos funcionais e Experimentos de transferência adotiva

O objetivo geral deste procedimento é isolar e marcar neutrófilos da medula óssea de camundongos para estudos funcionais a jusante e experimentos de transferência adotiva. Isso é feito coletando primeiro as células da medula óssea de murinos, fêmures e tíbia. Durante a segunda etapa, os glóbulos vermelhos são osmoticamente atados suspendendo-os sequencialmente em soluções de cloreto de sódio a 0,2% e 1,6%, respectivamente.

Em seguida, os neutrófilos são isolados por centrifugação com gradiente de densidade. Na etapa final, os neutrófilos são marcados com corantes rastreadores celulares. Em última análise, a citometria de fluxo pode ser usada para determinar o número de neutrófilos transferidos adotivamente recrutados para vários tecidos de camundongos.

A principal vantagem de isolar neutrófilos de camundongos da medula óssea sobre o sangue ou o peritônio é que o grande número de células suficientes para estudos funcionais a jusante e experimentos de transferência adotiva pode ser obtido da medula óssea durante o estado estacionário e após a infecção. A vantagem de usar uma técnica de centrifugação de gradiente para isolar neutrófilos de camundongo sobre a seleção imunomagnética de classificação de células ativadas por fluorescência é que ela é rápida, econômica e evita rotular os neutrófilos com anticorpos que podem induzir a ativação de neutrófilos. Demonstrando o procedimento será muca swami nós, um técnico do meu laboratório Depois de pulverizar um camundongo sacrificado com 70% de etanol.

Faça uma incisão na região abdominal média da pele do animal e, em seguida, remova o tecido cutâneo da parte distal do animal, incluindo as extremidades inferiores. Em seguida, use uma tesoura para cortar os músculos dos membros posteriores do animal e, em seguida, desloque cuidadosamente o corpo da ECA da articulação do quadril, evitando quebrar a cabeça do fêmur. Em seguida, use a tesoura em um bisturi para remover o músculo restante do fêmur e da tíbia.

Separe os ossos da perna na articulação do joelho, tomando cuidado para não quebrar as extremidades ósseas, e depois coloque os ossos em uma placa de Petri contendo RPMI 1 6 4 oh gelado. Suplemento com FBS e antibióticos. Transfira a placa para uma capa de cultura de tecidos e, em seguida, esterilize a parte externa de cada osso com etanol a 70% em uma nova placa de Petri.

Após cerca de 10 a 15 segundos, enxágue o etanol da superfície de cada osso com três lavagens subsequentes em PBS estéril e gelado. Em seguida, corte e coloque a epífise de cada um dos ossos em uma nova placa de Petri estéril. Em seguida, conecte uma agulha de calibre 25 a uma seringa de 12 cc cheia de 10 mililitros de RPMI.

Suplemento com FBS e EDTA. Em seguida, lave as células da medula óssea de ambas as extremidades da haste de cada par de tíbia do fêmur em um tubo Falcon com tampa de rosca de 50 mililitros desbotado com um filtro de 100 micrômetros para remover todas as células. Raspe as superfícies internas dos ossos com a ponta da agulha.

Quando os ossos parecem empalidecidos, as células foram suficientemente removidas. Agora use um bisturi para cortar as epífises ósseas em pequenos pedaços Q de 0,5 a um milímetro e, em seguida, use a extremidade traseira de uma ponta de pente einor de 2,5 mililitros mais a ponta da pipeta BioPure para esmagá-las através do filtro de 100 micrômetros. Depois de girar as células colhidas por sete minutos a 427 vezes G e quatro graus Celsius, os glóbulos vermelhos em 20 mililitros de cloreto de sódio a 0,2% por aproximadamente 20 segundos.

Em seguida, pare a lise com 20 mililitros de cloreto de sódio a 1,6%, gire as células e ressuspenda o pellet em suplemento RPMI 1 6 4 oh com FBS e EDTA. Conte as células e, depois de girá-las novamente, ressuspenda o pellet lavado em não mais do que 100 vezes 10 elevado a seis células por um mililitro de gelo. PBS estéril frio Agora dispensar três mililitros de 18 a 26 graus Celsius, seu opaco 1 1 1 9 em um tubo cônico de 15 mililitros e, em seguida, lentamente sobrepor três mililitros de 18 a 26 graus Celsius.

Seu opaco 1 0 7 7. Evitando misturar as duas densidades imediatamente após a preparação do seu opaco cuidadosamente camada a suspensão de células da medula óssea em cima do seu opaco 1 0 7 7 centrífuga, o gradiente de densidade por 30 minutos a 834 vezes G e 25 graus Celsius sem a quebra, e então coletar os neutrófilos na interface do seu opaco 1 1 1 9 e 1 0 7 7 camadas. Depois de lavar os neutrófilos coletados duas vezes em RPMI 1 6 4 oh FBS e antibióticos Resus suspender as células em cinco vezes 10 para as seis células por mililitro em PBS Pré-aquecer a 37 graus Celsius.

Depois de contar as células, reserve uma pequena alíquota de cada amostra experimental para determinar a pureza e viabilidade por citometria de fluxo e, em seguida, rotule os neutrófilos restantes com um corante rastreador de células a uma concentração final de cinco micromolares por 10 minutos a 37 graus Celsius em banho-maria agitado no escuro. Finalmente, lave as células duas vezes com suplemento de RPMI 1 6 4 oh gelado com FBS e antibióticos para evitar a contaminação cruzada do corante antes de misturar as populações de neutrófilos marcadas diferencialmente para estudos de repopulação competitiva a jusante aqui, gráficos de citometria de fluxo representativos de neutrófilos separados por gradiente de densidade isolado da medula óssea de um camundongo C 57 preto seis não infectado são mostrados neste painel. O gating inicial usado para as células da medula óssea coletadas da interface do histopata 1 1 1 9 e do histopata 1 0 7 7.

Usando dispersão direta e lateral é demonstrado que os neutrófilos separados pelo gradiente de densidade são maiores que 90% puros e maiores que 95% viáveis por pelo menos quatro horas após o rastreador de células de transferência adotivo. Os neutrófilos do marcador DIA podem ser rastreados por citometria de fluxo em vários problemas de camundongos. Por exemplo, no sangue, medula óssea e rins do receptor candida infectado C 57 preto seis camundongos mostrados neste experimento por gating no CD vivo 45 LY seis G CD 11 B células, esses neutrófilos marcados com CMTMR transferidos adotivamente podem ser diferenciados dos neutrófilos negativos CMTMR e PE nativos do camundongo receptor por sua expressão de PE.

Uma vez dominado, o isolamento e a marcação dos neutrófilos da medula óssea do camundongo podem ser concluídos em três horas.