High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

O objetivo geral deste procedimento é descobrir compostos novos que modulam a atividade de canais de potássio retificadores internos. Isso é realizado primeiramente semeando células HK 2 9 3, induzíveis por tetraciclina e expressando um canal KIR de interesse, em uma placa de 384 poços. O segundo passo é carregar as células com um corante fluorescente repórter de tálio denominado flu in two.

Em seguida, o corante não incorporado é removido das células por lavagem e substituído por tampão de ensaio contendo um controle veículo ou compostos em teste. O passo final é a adição de um tampão estimulante aos poços para iniciar o fluxo de tálio. Por fim, um leitor de placas de fluorescência é utilizado para identificar os compostos que alteram o movimento de íons de tálio através do canal KIR.Poor.

A principal vantagem deste método em relação a técnicas existentes, como a eletrofisiologia com patch clamp manual, é que ele permite ao pesquisador realizar centenas de experimentos simultaneamente e milhares de experimentos diariamente. Este método possibilita ao pesquisador triar bibliotecas de milhares de moléculas pequenas para descobrir moduladores de canais de potássio retificadores internos. Um dia antes do experimento de fluxo de tálio, dissocie as células e quantifique a densidade da suspensão celular conforme descrito no manuscrito anexo. Em seguida, utilize o meio BH contendo 10% de FBS dialisado para semear 20.000 células monoclonais estavelmente transfectadas com um gene de canal KIR de interesse em cada poço de uma placa de 384 poços revestida com amina BD PureCoat, usando um Multi Drop Combi térmico ou uma pipeta multicanal. No dia seguinte, inspecione a placa ao microscópio para garantir que as células estejam aderidas e uniformemente distribuídas no fundo dos poços.

Em seguida, utilize um lavador de microplacas ELX 405 para substituir o meio de cultura celular pelo tampão HBSS de ensaio, adicionando 20 microlitros por poço. Depois disso, prepare o flus na solução de carregamento 2:00 AM D centrifugando brevemente o tubo para dissolver 50 microgramas de flus em pó em 100 microlitros de DMSO anidro.

Agora, adicione 50 microlitros de uma solução de F1 27 ônico a 20% peso por volume em DMSO ao corante. Misture-os pipetando suavemente. Em seguida, adicione 150 microlitros de flus às 2:00 AM ônico F1 27 a 35 mililitros de tampão HBSS para ensaio e misture suavemente.

Em seguida, adicione 20 microlitros de tampão de carregamento de corante a cada poço que já contém 20 microlitros de tampão de ensaio HBSS. Incube as células à temperatura ambiente por aproximadamente uma hora enquanto as células carregam o corante. Prepare uma placa de estímulo com tálio dissolvendo recentemente 0,5 gramas de bicarbonato de sódio em 50 mililitros de tampão de estímulo de tálio cinco vezes concentrado.

Em seguida, adicione 50 microlitros da solução a cada poço de uma placa de polipropileno de 384 poços após as células terem sido carregadas com flus às 2:00 da manhã. Lave a placa com um lavador de microplacas ELX 405. A seguir, adicione 20 microlitros ou 40 microlitros do tampão de ensaio HBSS a cada poço e a placa está agora pronta para os experimentos.

Carregue as placas de tálio e as placas celulares em um sistema funcional de triagem de fármacos Hema Matsu ou leitor de placas com imagem cinética equivalente com capacidades integradas de dispensação de líquidos e utilize filtros apropriados para corantes baseados em fluoresceína, como flu oh four. Em seguida, configure um protocolo de adição única para adicionar 10 microlitros de cinco X Thallium series aos poços correspondentes da placa celular contendo 40 microlitros de tampão de ensaio HBSS. Então, registre a fluorescência de linha de base com uma frequência de amostragem de um hertz por pelo menos 10 segundos.

A fluorescência de poço a poço deve ser uniforme e estável ao longo da placa, uma vez que as condições ideais de semeadura celular, lavagem e carregamento forem estabelecidas. Enquanto isso, utilize o pipetador integrado de 384 canais para adicionar simultaneamente o tampão de estímulo com tálio a cada poço e continue o registro por pelo menos dois minutos, de modo que a taxa e o pico do aumento induzido por tálio na fluorescência sejam capturados para análise posterior. Na próxima série de experimentos, avalie a uniformidade e reprodutibilidade do ensaio semeando um inibidor controle em cada poço alternado de cada coluna e linha de uma placa de 384 poços e adicionando DMSO aos demais poços como controle de veículo.

Utilize um pipetador multicanal. Prepare uma placa de DMSO com compostos pipetando um inibidor do canal KIR-alvo na concentração determinada previamente, com 80 microlitros por poço e veículo contendo 0,1% de DMSO, em uma placa de polipropileno de 384 poços. Isso é feito adicionando-se um inibidor conhecido começando no poço A1, alternando para o poço B2 e assim sucessivamente até o poço B24.

Repita este procedimento com DMSO, iniciando no poço B1 e assim por diante até o poço A24. Agora, carregue a placa celular, a placa do composto e as placas com estímulo de tálio no leitor de placas. Em seguida, configure um protocolo de duas adições para adicionar 20 microlitros da série de compostos na concentração 2X aos poços correspondentes da placa celular contendo 20 microlitros de tampão de ensaio HBSS.

Adicione os compostos à placa de células e incube-os por até 20 minutos à temperatura ambiente. Registre o sinal basal de fluorescência em dois comprimentos de onda por pelo menos 10 segundos. Em seguida, adicione 10 microlitros de tampão de tálio 5x a cada poço da placa de células.

Repita o experimento em três dias consecutivos para estabelecer a reprodutibilidade dos resultados. Utilize o fluxo de tálio em células tratadas com DMSO e com fármaco para calcular um valor para o Z primo. Uma medida estatística da variabilidade de poço para poço entre as duas populações de poços, calcule o Z primo usando esta fórmula baseada nas médias e desvios padrão de P e N, onde P é o valor de fluxo não inibido e N é o valor de fluxo totalmente inibido.

Um ensaio com valores de ZPrime maiores ou iguais a 0,5 em três dias distintos é considerado adequado para triagem de alto rendimento. Essas figuras são alguns exemplos dos mapas de semeadura celular utilizados em diferentes tipos de experimentos. As posições dos poços contendo células não induzidas ou células induzidas por tetraciclina são indicadas em cores diferentes.

Esta figura mostra o mapa da placa original utilizado para determinar a concentração ótima de tálio para o desenvolvimento do ensaio e triagem de compostos. O gradiente de cores representa a série de diluição em triplo, variando de 100% a 0,002% de tálio, e aqui há um mapa representativo da intensidade de fluorescência com cores do frio ao quente, indicando valores baixos a altos de fluxo de tálio. O mapa de semeadura celular mostrado aqui, com o ajuste de uma função logística de quatro parâmetros à CRC do tálio, é utilizado para determinar um valor EEC 80 de 15% de tálio.

Esta figura mostra o mapa da placa fonte utilizado para determinar a tolerância ao DMSO em um ensaio. As colunas um e 24 contêm apenas tampão de ensaio, enquanto o gradiente de cor indica a série de diluição em duas vezes, variando de 10% a 0,01% de DMSO, e aqui há um mapa representativo da intensidade de fluorescência com valores baixos de fluxo de tálio indicados em azul mais escuro. Os valores médios de fluxo de tálio registrados nos poços contendo as concentrações indicadas de DMSO são resumidos aqui.

Agora, esta figura mostra o mapa da placa de origem utilizado para estabelecer curvas de resposta à concentração para os inibidores conhecidos de um canal KIR. Cada composto é indicado com uma cor diferente e geralmente é distribuído em série de diluição tríplice. Um mapa representativo da intensidade de fluorescência é mostrado aqui, e esta figura mostra a inibição dependente da dose do fluxo de tálio por um inibidor após seu desenvolvimento e otimização.

O ensaio de fluxo de tálio também pode ser utilizado para realizar uma variedade de ensaios de rotina em farmacologia. O ensaio de fluxo de tálio já foi previamente adaptado para uso com canais de potássio dependentes de voltagem e ligados a ligantes, canais catiônicos não seletivos e até transportadores de potássio. Não se esqueça de que trabalhar com tálio pode ser extremamente perigoso, e precauções, como o uso de luvas e descarte adequado de resíduos, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.