Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK
24 de abril de 2012
Um procedimento de triagem em tempo real para identificação de drogas que interagem com a proteína G-gate dentro retificador K + (GIRK) canais é descrito. O ensaio utiliza potencial de membrana sensíveis corantes fluorescentes para medir GIRK actividade do canal. Esta técnica é adaptável para utilização num certo número de linhas celulares.
O objetivo geral deste procedimento é identificar novas drogas que modulam os canais grk. Isso é realizado primeiramente cultivando as células A TT 20 na placa de 96 poços. O segundo passo é diluir os compostos-teste utilizando o sistema automático de manipulação de líquidos Verset.
Em seguida, os compostos-teste diluídos são aplicados às células utilizando o verset. O passo final consiste em inserir a placa de 96 poços no leitor de placas fluorescente Synergy dois e injetar as soluções controle e de somatostatina nos poços. Por fim, o leitor de placas fluorescente é utilizado para identificar os compostos que alteram o sinal fluorescente induzido pela somatostatina e, assim, modular os canais Grk.
A vantagem deste procedimento em relação a métodos existentes, como o registro por patch clamp, é que um grande número de compostos pode ser rapidamente triado para determinar se eles modulam canais Gerk. As implicações desta técnica estendem-se ao tratamento da dor, pois compostos que ativam o canal Gerk, o que leva à inibição da transmissão nociceptiva FI, podem ser identificados. Demonstrando o procedimento de revestimento. As placas de 96 poços e o plaqueamento das células são de responsabilidade de Maribel Vasquez.
Um aluno no meu laboratório inicia este procedimento cultivando as células pituitárias A TT 20 em DMEM suplementado com 10% de soro de cavalo a 37 graus Celsius em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Mantenha o cultivo repicando as células a cada cinco a sete dias usando um procedimento de padronização. Em seguida, recubra os poços da placa preta e transparente.
Placa de 96 poços com 50 microlitros de poli-L-lisina na parte inferior. Deixe os poços secarem por 30 minutos no incubador. Em seguida, remova o excesso de poli-L-lisina e plaque as células na placa de 96 poços contendo 200 microlitros de meio, na densidade de 30.000 células por poço.
Após isso, armazene as células no incubador por três a quatro dias. Utilize um sistema de aspiração para aspirar lentamente o meio de cultura da monocamada celular, depois lave as células com 200 microlitros de solução tampão normal. Posteriormente, adicione 200 microlitros de solução tampão contendo o corante sensível ao potencial de membrana a cada uma.
Incube bem as células por 40 minutos a 37 graus Celsius. Após 40 minutos, remova as células A TT 20 do incubador e deixe-as retornar à temperatura ambiente; aspire o antigo tampão. Em seguida, adicione uma solução fresca de tampão contendo o MPD às células.
Em seguida, utilize o sistema de manipulação de líquidos para aplicar várias concentrações dos compostos em teste e soluções controle às células. Na placa de 96 poços, incubar as células por cinco minutos com os compostos em teste antes das medições fluorescentes. Neste procedimento, inserir a placa de 96 poços em um leitor de placas fluorescente Biotech Synergy Two.
Obtenha o sinal de fundo fluorescente no comprimento de onda de excitação de 520 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 560 nanômetros. Em seguida, aplique os ligantes do receptor acoplado à proteína G ou a solução controle aos poços para ativar os canais GIR utilizando o sistema de injeção Synergy dois. Então, colete os pontos de dados em intervalos de dez segundos durante um período de amostragem de 302 segundos.
Nos comprimentos de onda de excitação e emissão. Calcule o fator Z para determinar a confiabilidade do ensaio. Fatores Z na faixa de 0,5 a 1,0 indicam que a qualidade do ensaio é excelente.
Placas com fatores Z abaixo de 0,5 são excluídas. A partir da análise, compostos que modulam o sinal fluorescente são retestados na presença de cloreto de bário a dois milimolares ou terapina Q a 500 nanomolares para confirmar a especificidade do canal de potássio retificador interno. Abaixo, mostra-se um sinal fluorescente representativo do HLB 0 2 1 1 15 2 medido ao longo do tempo nas células A TT 20 com a adição de somatostatina ou solução controle. A razão da intensidade fluorescente no eixo Y foi calculada dividindo-se o sinal na presença de somatostatina ou da solução controle pelo sinal de linha de base medido antes da adição de somatostatina ou solução controle.
Mostra-se aqui o tratamento das células A TT 20 com 500 nanomolares. A terapina Q inibe a diminuição mediada por somatostatina no sinal fluorescente ao se ligar a dois e bloquear os canais G. E mostra-se aqui o tratamento das células A TT 20 com 20 micromolares de propafenona, que também inibe a diminuição mediada por somatostatina no sinal fluorescente. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em duas horas, se executada corretamente.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como identificar fármacos que modulam canais grk utilizando um leitor de placas fluorescente.
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Visão Geral
Este artigo descreve um procedimento de triagem em tempo real para identificar fármacos que interagem com canais de potássio retificadores internos ativados por proteína G (GIRK). O ensaio utiliza corantes fluorescentes sensíveis ao potencial da membrana para medir a atividade dos canais GIRK, tornando-o adaptável a diversas linhagens celulares.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Farmacologia
- Neurociência
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- Os canais GIRK desempenham um papel crucial na sinalização neuronal.
- A identificação de moduladores dos canais GIRK pode levar a novas estratégias terapêuticas.
- Ensaios em tempo real aumentam a eficiência do triagem de fármacos.
- Corantes fluorescentes fornecem uma medida sensível da atividade do canal.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um procedimento para triagem de fármacos que modulam canais GIRK.
- Utilizar um formato de alto rendimento para testar múltiplos compostos.
- Aprimorar o entendimento da farmacologia dos canais GIRK.
Métodos Utilizados
- Placar células A TT 20 em uma placa de 96 poços.
- Utilizar o sistema de manipulação de líquidos Verset para diluir os compostos em teste.
- Aplicar os compostos diluídos às células com o Verset.
- Utilizar um leitor de placas fluorescente Synergy dois para medir as respostas.
Resultados Principais
- Identificação de compostos que alteram sinais induzidos por somatostatina.
- Demonstração da adaptabilidade do ensaio a diversas linhagens celulares.
- Modulação bem-sucedida da atividade dos canais GIRK por compostos testados.
- Validação da eficácia do leitor de placas fluorescente no processo de triagem.
Conclusões
- O ensaio desenvolvido é uma ferramenta valiosa para a descoberta de fármacos direcionados aos canais GIRK.
- A triagem em tempo real pode acelerar a identificação de terapêuticas potenciais.
- São necessários estudos adicionais para explorar as implicações clínicas dos compostos identificados.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este ensaio permite a identificação em alto rendimento de moduladores do canal GIRK, apoiando a validação de alvos na descoberta de fármacos em neurociência e na área cardiovascular. Ao fornecer leituras fluorimétricas quantitativas em tempo real, reduz a dependência da eletrofisiologia de baixo rendimento e acelera a progressão de hits para liderança. O método aumenta a confiança preditiva no estágio inicial da descoberta, associando os efeitos dos compostos à atividade funcional do canal em um contexto celular fisiologicamente relevante.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Avalia hipóteses terapêuticas mediante a medição da modulação funcional de canais GIRK em resposta a ligantes de RCPG.
- Valor Operacional: Permite triagem rápida de bibliotecas de compostos para identificar ativadores ou inibidores com especificidade mecanicista.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos do alvo ao confirmar atividade no alvo por meio de alterações no sinal de fluorescência correlacionadas com o efluxo de K⁺.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Utiliza corantes sensíveis ao potencial da membrana (DiBAC4(3) ou HLB 021-152) para gerar sinais quantificáveis em tempo real após a ativação de GIRK.
- Reprodutibilidade: O cálculo do fator Z (faixa excelente: 0,5–1,0) garante a robustez do ensaio para seleção de hits e reprodutibilidade de campanhas.
- Escalabilidade: Compatível com formato de 96 poços e sistemas de manipulação de líquidos (por exemplo, Verset) para dispensação automatizada de compostos e triagem.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Os moduladores identificados podem orientar estratégias terapêuticas para dor neuropática, dependência e arritmias cardíacas por meio da inibição neuronal mediada por GIRK.
- Continuidade Translacional: Leituras fluorescentes fornecem uma ponte entre o engajamento do alvo e a saída funcional, apoiando o ancoramento fenotípico pré-clínico.
- Redução de Riscos Mecanísticos: A especificidade é confirmada usando inibidores como cloreto de bário ou Terapina Q para distinguir efeitos mediados por GIRK de atividades fora do alvo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O ensaio insere-se no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a identificação de compostos iniciais, permitindo a triagem funcional de moduladores de GIRK antes da otimização posterior.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar a ativação de receptores acoplados à proteína G (GPCR) a alterações na fluorescência dependentes de GIRK, esclarecendo a modulação da via.
- Triagem: Oferece prontidão para ensaios por meio do carregamento padronizado de corante, aplicação de compostos e medição cinética da fluorescência ao longo de 300 segundos.
- Análises: Gera medições quantitativas de variáveis dependentes (razões de intensidade de fluorescência), permitindo a comparação da potência e eficácia de compostos.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se ao trabalho pré-clínico ao identificar compostos que alteram a excitabilidade neuronal por meio de GIRK, relevante para modelos de dor e dependência.
- Reutilização Empresarial: Plataforma adaptável a diferentes linhagens celulares e ligantes de GPCR, promovendo reutilização em múltiplas campanhas de validação de alvos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Fornece confiança preditiva na modulação do alvo ao reduzir a ambiguidade mecanicista na triagem de fármacos para canais iônicos.
- Valor Operacional: Oferece padronização, reprodutibilidade e dados cinéticos em tempo real inatingíveis com ensaios de ponto final.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar ao permitir a validação funcional precoce, reduzindo o risco de falha em estágios tardios devido à ausência de interação com o alvo.
- Impacto na Carteira: Facilita a priorização ajustada ao risco de compostos com atividade GIRK confirmada para avanço à otimização de fármacos líderes.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em cultura celular (células AT T20), manuseio de corantes fluorescentes e operação de leitora de placas cinética.
- Depende de leitora de placas com capacidade de injeção (por exemplo, Synergy 2) e configurações compatíveis de excitação/emissão (520 nm/560 nm).
- Necessita padronização do carregamento do corante, tempos de incubação e condições de tampão entre poços e placas.
- A adaptação a outras linhagens celulares requer validação da expressão de GIRK e da eficiência de carregamento do corante.
- Limitação prática: A especificidade do ensaio deve ser confirmada usando inibidores ortogonais (por exemplo, Ba²⁺, Terapin Q) para excluir alterações fluorescentes não mediadas por GIRK.
