High Throughput ELISA sequencial para a validação dos biomarcadores da doença enxerto-versus-hospedeiro aguda

O objetivo geral do experimento a seguir é utilizar o Eliza sequencial de alto rendimento para analisar de forma eficiente um grande número de novos biomarcadores descobertos por proteômica. Isso é alcançado primeiramente adicionando amostras a uma placa de origem, que é usada para criar diluições de cada biomarcador e armazenar o plasma recuperado entre os testes. Em seguida, são realizados ensaios Eliza para cada proteína a fim de determinar suas concentrações nas amostras dos pacientes.

Por fim, pode-se avaliar o aumento dos níveis protéicos desses biomarcadores no início das manifestações clínicas da doença do enxerto contra o hospedeiro aguda. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é que analisadores sequenciais podem analisar múltiplas proteínas novas que nem sempre estão disponíveis em plataformas de multiplexação elevada. As implicações desta técnica estendem-se para o diagnóstico da doença do enxerto contra o hospedeiro aguda.

Como biomarcadores validados por meio deste método estão atualmente sendo investigados para cuidados clínicos. Embora este método possa fornecer informações sobre complicações no transplante de células-tronco pós-traumático, ele também pode ser aplicado à descoberta e validação de biomarcadores para outras doenças, como transplante de pulmão, complicações, câncer de pulmão ou potencialmente qualquer doença para a qual um teste sanguíneo diagnóstico seja útil.

A demonstração visual deste método é essencial, pois é importante que as múltiplas etapas sejam realizadas de forma consistente para garantir a reprodutibilidade e baixa variabilidade entre lotes. No dia anterior ao experimento, centrifugue alíquotas de plasma por 10 minutos a 15.300 RCF e quatro graus Celsius para separar os coágulos na parte inferior e os lipídios na parte superior do plasma. Em seguida, plaque 150 microlitros de plasma não diluído de cada amostra em uma placa de fundo V de 96 poços, utilizando pipetagem manual de acordo com mapas predefinidos. Envolva a placa em Parafilm e coloque-a em uma câmara umedecida a quatro graus Celsius por até 72 horas.

Em seguida, após a reconstituição e diluição do receptor alfa de IL-2 e do fator de crescimento hepatocito (ou HGF) de acordo com as especificações do fabricante, distribua alíquotas de 50 microlitros de cada anticorpo em cada poço de placas de 96 poços com metade do volume e alta ligação. Em seguida, feche essas placas com um selante para placas e incube-as durante a noite a quatro graus Celsius. Agora, dilua o reg-3α com o tampão de revestimento do fabricante de acordo com o protocolo fornecido e distribua 25 microlitros da solução em cada poço de uma placa de 384 poços sem revestimento máximo.

Em seguida, armazene esta placa selada a quatro graus Celsius também no primeiro dia do experimento. Comece lavando a placa de teste do receptor alfa da IL-2 e bloqueando-a com blotto em TBS. Após a reconstituição do padrão, prepare uma curva padrão de oito pontos conforme o protocolo do fabricante.

Em seguida, transfira 50 microlitros de plasma não diluído e 50 microlitros de cada padrão em duplicata da placa de origem para a placa de teste ELIZA. Incube então a placa vedada à temperatura ambiente em um agitador rotativo ajustado a 300 RPM. Após duas horas, recupere o plasma da placa de teste ELIZA do receptor IL-2 alfa e devolva-o à placa de origem de plasma não diluído.

Em seguida, após concluir o EIA conforme o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado em 450 a 570 nanômetros para o Eliza rich three alpha. Primeiro, transfira 10 microlitros de plasma não diluído para uma placa matriz com fundo transparente separada e, em seguida, adicione 90 microlitros do tampão de diluição fornecido pelo fabricante a cada poço para criar uma placa matriz com diluição de 1 para 10. Após concluir o Eliza Reg three alpha, conforme o protocolo do fabricante, adicione a solução de parada à placa de 384 poços e leia a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado em 450 a 620 nanômetros. Após a reconstituição e diluição dos anticorpos de captura elephant e tn FFR um conforme as especificações do fabricante, codifique cada poço das respectivas placas de 96 poços com meia parede de alta ligação com 50 microlitros dos anticorpos de captura.

Em seguida, incubar as placas de teste seladas durante a noite à temperatura ambiente para a placa de elefante e a quatro graus Celsius para a placa TN FFR. Após a conclusão da transferência do receptor alfa IL dois Eliza, transferir 60 microlitros de plasma não diluído para uma nova placa de origem. Em seguida, adicionar 60 microlitros de BSA 1% em PBS a cada poço para obter uma placa de origem de plasma diluída na proporção de um para dois.

Em seguida, lave e bloquee a placa de teste de HGF com BLOTTO em TBS e prepare a curva padrão de oito pontos por diluição. Após lavar a placa, após a etapa de bloqueio, adicione alíquotas duplicadas de 50 microlitros de plasma diluído um a dois e de cada padrão na placa de teste EISA. Incube então a placa selada durante a noite à temperatura ambiente em um rotador de placas ajustado a 300 RPM.

Na manhã seguinte, recupere o plasma diluído na proporção de um para dois da placa do teste Eliza de HGF e coloque-o novamente na placa de origem do plasma diluído na proporção de um para dois. Após a conclusão do EIA, de acordo com o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado entre 450 e 570 nanômetros no segundo dia do experimento. Primeiro, transfira 10 microlitros de plasma não diluído para uma nova placa de origem e, em seguida, adicione 190 microlitros de BSA 1% em PBS para obter 200 microlitros de plasma diluído na proporção de um para 20.

Em seguida, após a conclusão do ensaio para elefante, Eliza leu a densidade óptica utilizando um leitor de placas ajustado a 450 a 570 nanômetros, de acordo com o protocolo do fabricante. Para o TN FFR um, Eliza adicionou inicialmente 25 microlitros de BSA 1% em PBS à placa matriz um para 20, resultando em 125 microlitros de plasma diluído um para 25 por poço. Então, após completar o ensaio TN FFR um EIA conforme o protocolo do fabricante, leu-se a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado a 450 a 570 nanômetros; para o I-L-H-E-I-A, transferiu-se inicialmente 60 microlitros de plasma diluído um para dois para uma nova placa matriz e, em seguida, adicionaram-se 180 microlitros de diluente de IL oito a cada poço, obtendo-se uma placa matriz de plasma diluído um para seis.

Em seguida, após concluir o ELISA ILH conforme o protocolo do fabricante, leia a densidade óptica de cada poço utilizando um leitor de placas ajustado entre 450 e 570 nanômetros. Por fim, após a conclusão de todos os ELISAs, devolva o plasma sobressalente não utilizado ao tubo Eloqua e congele para uso futuro. Neste gráfico, as densidades ópticas da curva padrão de sete placas diferentes de ELISA, que medem as concentrações de reg três alfa correspondentes aos 1084 pacientes testados no relatório inicial do biomarcador de doença do enxerto contra o hospedeiro gastrointestinal reg três alfa, demonstram densidades ópticas consistentes entre as placas, o que garante medidas consistentes de concentração proteica entre experimentos.

As concentrações das proteínas nas amostras de plasma foram calculadas comparando as densidades ópticas das amostras com as densidades ópticas da curva padrão. Uma plataforma robótica de manipulação limpa pode ser utilizada para aumentar ainda mais a reprodutibilidade, além de reduzir o volume de plasma utilizado ao realizar ELISA em placas de poços de formato criativo. Ao planejar este procedimento, é importante realizar EIS com plasma não diluído primeiro, para que possa ser recuperado e usado em experimentos posteriores após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores na área de proteômica explorarem biomarcadores candidatos em qualquer doença de interesse por meio do uso universal de Eliza sequenciais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como validar múltiplos biomarcadores utilizando E sequencial, empregando pequenos volumes de plasma e minimizando ciclos livres.