Medição quantitativa da resposta imune e do sono em

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar o sono e a função imunológica em drosófila. Isso é primeiramente alcançado por meio do registro da atividade locomotora de moscas infectadas para medir o sono, e da sobrevida como segundo passo após a infecção, as moscas são homogeneizadas, diluídas e espalhadas em placas de ágar LB. O número de unidades formadoras de colônias que crescem indica a capacidade das moscas de eliminar a infecção.

Em seguida, moscas infectadas que expressam um transgene contendo o repórter luciferase de NF kappa b são adicionadas a uma placa de 96 poços contendo luciferina, o substrato da luciferase. A medição em tempo real da luciferase kappa b indica a ativação de uma via de sinalização NF kappa B durante a infecção, considerando em conjunto o resultado de sobrevivência e sono. A eliminação bacteriana e a atividade do repórter NF KB são medidas que fornecem subsídios mecanicistas sobre a ligação molecular entre função imunológica e comportamento.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque leva tempo e prática aprender a infectar manualmente as moscas com consistência. A principal vantagem da técnica com o gene repórter Lucifer em relação aos métodos existentes, como a QPCR, é que a atividade do NF Kappa B pode ser medida continuamente em tempo real em organismos vivos. Comece incubando culturas de drosófila em estágio tardio de pupa por três a quatro dias, para que os adultos se adaptem às condições ambientais.

Aqui, as moscas são mantidas sob luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano na resposta imune e no comportamento. Em seguida, carregue moscas de um a quatro dias de idade no monitor de atividade. Os monitores registram sua atividade por um mínimo de três dias antes da infecção, um dia antes da infecção programada.

Escolha uma única colônia de SIA com uma ponteira estéril e mergulhe a ponteira em um tubo de cultura contendo cinco mililitros de meio LB para verificar a técnica estéril. Não se esqueça de preparar um cultivo controle simulado sem bactérias. Incube as bactérias durante a noite até atingirem a fase de crescimento exponencial no dia seguinte.

Meça a absorbância do cultivo a 600 nanômetros. Inclua um segundo Q vet como branco. Está pronto quando a concentração estiver entre 0,5 e uma unidade de absorbância subcultivo, ou prolongue o tempo de cultivo conforme necessário.

Agora prepare a solução bacteriana para infectar as moscas. Dilua as bactérias com PBS para uma absorbância esperada de 0,1 a 600 nanômetros. Em seguida, adicione corante alimentar como controle da injeção.

Substitua as bactérias pelo meio LB. Armazene ambas as soluções em gelo. Em seguida, utilizando um puxador de micropipetas, prepare agulhas de injeção com ponta fina sob um microscópio estereoscópico.

Use pinças finas para quebrar a ponta de cada agulha, de modo que a abertura seja grande o suficiente para ser preenchida com o líquido de injeção por sucção, mas também pequena o suficiente para minimizar danos à mosca. Fixe uma agulha de vidro a uma seringa plástica de três cc com um trecho de tubo usando a seringa. O fluxo do meio de injeção é controlado manualmente.

Evite contaminar a tubulação de borracha com o fluido de injeção, pois o equipamento de seringa é usado tanto para injeção infecciosa quanto para controle. Verifique o fluxo do meio de injeção utilizando um lenço de papel Kim. Dois aspectos fundamentais para injeções bem-sucedidas são o uso do tamanho ideal de agulha e o selamento seguro entre a agulha e a seringa.

Uma vez que o sistema de injeção esteja completamente preparado, anestesie as moscas usando um fluxo mínimo de dióxido de carbono, agindo rapidamente para que nenhuma mosca permaneça anestesiada por mais de cinco minutos. Agora injete as moscas introduzindo a agulha de vidro na região acima do escutelo do tórax dorsal. A passagem do meio de injeção para dentro da mosca é verificada pelo corante alimentar, que pode ser observado enquanto a solução injetada se espalha.

Antes de começar, certifique-se de que todos os materiais utilizados para este procedimento tenham sido autoclavados com pelo menos um dia de antecedência. Prepare placas de Petri de 10 centímetros com meio de ágar LV. No dia do experimento, anestesie e coloque as moscas em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.

Prepare um mínimo de dois grupos de 10 moscas cada por condição experimental. Prepare também um grupo controle de moscas sem infecção, especialmente ao utilizar uma linhagem bacteriana sem resistência a antibióticos. Armazene todos os tubos carregados em gelo.

Em seguida, adicione 400 microlitros de meio LB a cada tubo contendo moscas. Homogeneíze as moscas usando um pequeno pistilo, fazendo isso próximo à chama para prevenir contaminação. Agora, utilizando ponteiras de pipeta cortadas, faça diluições seriadas do homogenato em fatores de 10 em volumes de 200 microlitros.

Se o homogeneizado for preparado imediatamente após a infecção com sia, faça diluições de até um para 1000, mas para o homogeneizado coletado 24 horas após a infecção, faça diluições de até um para 100.000. Em seguida, plaque as duas maiores diluições em placas de 10 centímetros utilizando bolas de vidro para garantir uma distribuição uniforme e incube as placas durante a noite. No dia seguinte, conte o número de colônias na placa por observação direta ou por meio de software de contagem de colônias.

Em seguida, calcule o número de unidades formadoras de colônia por mosca. Este ensaio utiliza moscas transgênicas portadoras do repórter luciferase kappa b no momento apropriado. O ensaio também requer bactérias cultivadas, como a SCIA, preparadas para injeção conforme descrito na seção anterior.

Ajuste as moscas às condições experimentais de iluminação. Neste exemplo, moscas de um a quatro dias de idade com luciferase kappa b são mantidas em frascos contendo meio alimentar de 5% sacarose e 2% ágar, e colocadas em luz constante por dois dias. Agora, prepare uma microplaca de 96 poços para as moscas.

Encha cada poço com duas camadas de alimento. Primeiro, coloque o meio, adicionando 300 microlitros de uma solução de 5% de sacarose e 2% de ágar a cada um. Em seguida, cubra a placa com um tecido de malha fina e deixe secar completamente por até uma hora.

Em seguida, adicione uma camada superior de 50 microlitros a cada poço contendo 5% de sacarose, 1% de ágar e duas milimolares de Lucifer. Como o Lucifer é sensível à luz, deixe a placa secar no escuro a partir de agora. Minimize a exposição da placa à luz.

Uma vez que o ágar tenha esfriado, cubra a placa com filme adesivo transparente. Em seguida, usando uma agulha fina, perfure o filme duas vezes sobre cada poço. Esses orifícios permitem a troca de ar e a anestesia gasosa.

Em seguida, para facilitar o carregamento das moscas, utilize uma lâmina afiada e uma borda reta para fazer um corte entre cada coluna. Anestesie as moscas com dióxido de carbono e carregue-as uma a uma em cada poço, coluna por coluna. Caso uma mosca fique presa ao filme, dê a ela a oportunidade de se soltar antes de intervir.

Retorne a placa de microplacas ao incubador sob luz constante por oito a 24 horas. Para anestesiar as moscas fixadas nos poços, utilize uma ponteira de micropipeta conectada a uma linha de dióxido de carbono de baixa pressão. Certifique-se de que o gás esteja a uma pressão inofensivamente baixa e posicione a ponteira de micropipeta diretamente acima dos orifícios de ventilação para anestesiar uma mosca em grupos de oito individualmente.

Transfira cada mosca para uma placa de CO2 e infecte-as com bactérias como anteriormente. Em seguida, devolva cada mosca ao seu poço original e resele a microplaca. Meça a luminiscência em cada mosca utilizando um luminômetro acondicionado em um ambiente com temperatura controlada e sob uma programação luminosa definida.

Carregue as placas no cassete empilhador, certificando-se de empilhar as placas contendo as moscas entre placas vazias transparentes. Programe o luminômetro de acordo com as especificações do fabricante e colete leituras a cada hora por um mínimo de 24 horas. Neste exemplo, os detectores são programados para ler cada poço durante 10 segundos.

Uma vez concluído, exporte os arquivos de dados para uma planilha e realize uma análise padrão graficando os resultados. Os dados de exemplo podem ser analisados. Descontos por segundo médios a partir de três leituras por poço.

Moscas selvagens Canton S e moscas mutantes relish. E 20 deficientes no gene NF kappa B foram carregadas em dois monitores de atividade em luz constante e infectadas com sia. Neste exemplo, a infecção promoveu o sono.

Ficou claro que mutantes relish E 20 apresentaram menos sono do que moscas Canton s. controle após infecção. Conforme observações anteriores, os mutantes relish E 20 também sucumbiram rapidamente à infecção em comparação com moscas selvagens.

A maioria das moscas sobreviveu à injeção controle asséptica, indicando que as moscas sucumbiram à infecção e não ao dano causado pela injeção. Como os mutantes relish morreram muito rapidamente, apenas moscas Canton s foram utilizadas para demonstrar a carga bacteriana após a infecção. Sia continuou a proliferar na mosca 24 horas após a infecção.

A atividade do repórter Lucifer mostrou grande variação entre moscas individuais e entre a qualidade dos pontos de dados. Embora o sinal seja derivado de todos os tecidos dentro da mosca, não se espera que cada tecido emita a mesma quantidade de sinal, e a visibilidade do tecido para o detector variaria conforme a mosca se move. Neste exemplo, as moscas foram infectadas e comparadas com um grupo controle manipulado.

Moscas que morreram foram excluídas da análise em um grupo de moscas. A atividade do repórter Luciferase Kappa b aumenta progressivamente após a infecção. A atividade do repórter Luciferase Kappa b também aumentou progressivamente após lesão asséptica.

A atividade máxima foi de aproximadamente 12 horas tanto após lesão quanto após infecção. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar a função imunológica e o sono em SSO após infecção. Podemos medir o sono, a sobrevivência, o tempo, a eliminação bacteriana e a atividade em tempo real de um repórter de transcrição não copiado.