O objetivo geral deste procedimento é isolar vesículas F1 F zero APAs do cérebro de rato para realizar gravações por patch clamp. Isso é realizado primeiramente removendo o cérebro de um rato e homogeneizando-o. O segundo passo é romper as zonas sinápticas aplicando pressão.

Em seguida, os sinaptossomos são depositados sobre os gradientes de frasco. O passo final é a incubação com digitonina e L para obter as vesículas finais para gravação por patch clamp. Uma função importante das mitocôndrias é a produção de TP por fosforilação oxidativa.

A enzima responsável pela produção de TP é a ATP sintase localizada na membrana interna mitocondrial. Para estudar em detalhes a função da ATP sintase, isolamos vesículas submitocondriais especiais que chamamos de VSMs. Elas contêm a enzima ATP sintase em uma configuração invertida (lado interno para fora).

Em seguida, registramos esses PPM com um eletrodo de grampo de patch e determinamos a vazão de sua membrana. Isso nos informa sobre a eficiência da produção de TP pelas mitocôndrias. Demonstrando este procedimento hoje será Sylvia Ti, pesquisadora pós-doutoranda no meu laboratório na Universidade de Yale.

Neste procedimento, após obter a cabeça de uma rata por decapitação, corte a pele para expor o crânio e, em seguida, abra o crânio suavemente cortando-o com uma tesoura ou Rons. Posteriormente, remova o cérebro, pique o cérebro sem o cerebelo finalmente isolado, tamponado, e então transfira-o para um homogeneizador de vidro e teflon de cinco mililitros, homogeneizando o tecido suavemente 10 vezes, aproximadamente cinco minutos no total. Depois disso, centrifugue a amostra a 1.500 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada.

Guarde o sobrenadante com mitocôndrias e sinaptossomos e descarte o precipitado. Em seguida, centrifugue novamente a 16.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada. Depois, descarte o sobrenadante e re-suspenda o precipitado em 500 microlitros de tampão de isolamento. Rompa os sinaptossomos com um recipiente de disruptura celular aplicando uma pressão de 1.200 PSI durante 10 minutos, seguida por descompressão rápida. Deposite as zonas sinápticas disruptadas sobre tubos de centrífuga contendo duas concentrações diferentes de fial, que formarão duas camadas.

Em seguida, coloque os tubos em um rotor SW 50.1 e centrifugue a 126.500 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em uma ultracentrífuga, o pellet corresponde às mitocôndrias purificadas. A camada entre as diferentes densidades do fial é o sinaptossomo não rompido.

Posteriormente, lave o pellet por centrifugação no tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada. Agora, ressuspenda as mitocôndrias em 200 microlitros de tampão de isolamento, combinado com um volume igual de digitonina 1%.

Coloque-o no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione mais tampão de isolamento e centrifugue a 16.000 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Repita este procedimento duas vezes, depois re-suspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de isolamento e adicione dois microlitros de 10% Lu bra, PX, misture e coloque no gelo por 15 minutos.

Após isso, sobreponha a mistura no tampão de isolamento nos tubos de centrífuga. Coloque os tubos em um rotor SSW 50.1 e centrifugue a 182.000 ×g a quatro graus Celsius por uma hora. Após uma hora.

Lave a paleta final por centrifugação no tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Um equipamento típico de eletrofisiologia inclui um amplificador, um computador PC equipado com um Digi Data 1.440, uma interface conversora analógico-digital em conjunto com o software P-Clamp 10.0, manipuladores, um microscópio, uma mesa de isolamento de vibrações e uma gaiola de Faraday. Primeiro, puxe uma pipeta a partir de um tubo capilar de vidro borossilicato em um puxador de micropipetas tipo flaming brown.

A resistência ideal da pipeta deve estar entre 80 e 100 mega ohms. Adicione as vesículas submitocondriais em uma solução intracelular fisiológica. Em seguida, preencha uma pipeta para grampo de patch com a mesma solução.

Visualize os vesículos em contraste de fase. Microscopia após os SMVs serem selados à temperatura ambiente. Registre a atividade quando o potencial da membrana for mantido na faixa de menos 100 milivolts a mais 100 milivolts durante 10 segundos em cada período.

Os dados registrados são filtrados em cinco quilohertz utilizando a circuitaria do amplificador e analisados com o software ClampFit 10.0. Esta figura mostra a chapa de lisado preparado a partir do citosol e mitocôndrias. O painel superior mostra um imunoblot utilizando um anticorpo contra a proteína citosólica GA dh.

O painel inferior mostra uma eletroforese usando um anticorpo contra a proteína da membrana interna mitocondrial. Cox quatro Aqui estão duas gravações representativas de patch clamp antes e após a adição de um milimolar de ATP. O potencial de retenção é de mais 70 milivolts. A linha tracejada representa zero picoampères.

Cada traçado é registrado durante 10 segundos, com intervalos de 10 segundos entre os traçados. Abaixo estão exemplos de traçados mostrando as alterações na intensidade de fluorescência do indicador CMA ao longo do tempo, na presença de VSMs e na ausência ou presença de TP. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar mitocôndrias e vesículas submitocondriais contendo a ATP sintase F1 FO 80 TP. Além disso, você deverá compreender como formar um selo resistente do tipo "gigaseal" com um eletrodo na membrana da vesícula, a fim de analisar a atividade do canal da complexo ATP sintase.