Usando Quantitative PCR em tempo real para determinar enxerto célula dadora num modelo murino de osso Competitiva Marrow Transplantation

O objetivo geral deste procedimento é realizar uma técnica baseada em PCR para quantificar o enxerto de células doadoras em um modelo competitivo de transplante de medula óssea murina, isso é realizado primeiro realizando o transplante de medula óssea em camundongos receptores fêmeas usando células de doadores machos. Em seguida, o sangue periférico é coletado de camundongos receptores em diferentes momentos e o DNA genômico é isolado. As amostras são preparadas para uma curva padrão.

Finalmente, a PCR em tempo real é realizada com amostras padrão e amostras de teste. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram o enxerto de células derivadas de doadores masculinos nos camundongos receptores femininos por meio do cálculo em relação a uma curva padrão com uma porcentagem conhecida de DNA masculino versus feminino. A vantagem masculina desta técnica sobre o método existente, como um método baseado em citometria de fluxo, é que ela é mais sensível, mais econômica e as amostras podem ser armazenadas por um longo tempo.

Mais importante ainda, nossa técnica é mais independente de cordas e pode ser usada para qualquer fundo genômico de camundongos, como marcador de superfície celular bem definido para diferenciar a célula doadora das células receptoras Depois de sacrificar FVB nj, camundongos doadores machos e fêmeas sob uma capa de fluxo laminar usam pequenas tesouras e fórceps para dissecar os ossos do fêmur e da tíbia e colocá-los em uma placa de cultura de tecidos de 60 milímetros contendo seis mililitros de gelo frio RPMI 1640 com 5% de calor inativado. A FBS usa um lenço Kim para remover músculos e outros tecidos e corta as duas extremidades de cada haste óssea no prato. Em seguida, conecte a extremidade dos ossos a uma agulha de calibre 23 conectada a uma seringa de três cc cheia de RPMI 1640 com FBS inativado por 5% de calor e lave a medula.

Use a mesma agulha para desagregar o tecido da medula óssea por aspirações repetidas. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mililitros e gire-o por cinco minutos a 400 G. Depois de remover o sobrenada, ressuspenda as células em um mililitro de temperatura ambiente, lise de glóbulos vermelhos, tampão e incube em temperatura ambiente por cinco minutos antes de adicionar cinco a 10 mililitros de RPMI 1640 com 5% de FBS inativado por calor, passe as células por um filtro de células e colete o fluxo em um novo tubo. Depois de girar as células por cinco minutos a 400 G e remover o sobrenadante, o pellet deve estar ausente da cor vermelha, indicando a remoção completa dos glóbulos vermelhos ressuspensos em 10 mililitros de RPMI 1640 com FBS inativado por 5% de calor após vórtice suave, adicione uma pequena alíquota a um hemocitômetro e conte as células.

Calcule o volume de células necessárias para se misturar com células femininas concorrentes em uma proporção de cinco para dois para transplante de medula óssea. Como etapa final para preparar as células para injeção, misture as células doadoras e concorrentes em pellet as células, lavem com PBS e ressuspendam em PBS a uma concentração final de cinco vezes 10 elevado a sexto por mililitro de células doadoras e duas vezes 10 elevado a sexto por mililitro para células concorrentes, quatro a seis horas antes do transplante de medula óssea. Irradiar camundongos receptores fêmeas com radiação gama de césio 1 37 em uma dose única de 11 cinzas.

Coloque os camundongos fêmeas irradiados em um limitador de camundongo e injete as células mistas doadoras e concorrentes através da veia da cauda em um volume total de 0,1 mililitro, de modo que cada camundongo receba cinco vezes 10 para as quintas células doadoras e duas vezes 10 para as quintas células da medula óssea concorrentes para coletar amostras de sangue. Após a anestesia, os camundongos coletam cerca de 50 microlitros de sangue em tubos revestidos com EDTA por sangramento retroorbital. Colete também amostras de camundongos machos e fêmeas da mesma idade.

Em seguida, isolar o DNA genômico de camundongos e camundongos sujeitos. Para a curva padrão, adicione cerca de 200 microlitros de tampão de lise de hemácias à temperatura ambiente a cada amostra de sangue e incube por cinco minutos. Adicione um mililitro de PBS e gire para baixo para remover a maioria dos eritrócitos lisados.

Em seguida, use um kit de extração de DNA sanguíneo para isolar o DNA pré-aquecendo o tampão eluciano a 37 graus Celsius. Para aumentar o rendimento, meça a concentração de DNA de cada amostra. Aqueles com uma razão OD de dois 60 para dois 80 entre 1,8 e 2,0 são usados para análise posterior.

Para estabelecer uma curva padrão, dilua o DNA masculino e feminino a uma concentração de quatro nanogramas por microlitro e prepare a mistura de DNA de acordo com essas diretrizes. Configure a placa de reação de PCR misturando o reagente de super mistura verde cibernético com os primers mostrados aqui e o DNA genômico. Cada reação de 20 microlitros contém 400 nano molares de cada primer e cinco microlitros de DNA genômico de células sanguíneas em triplicata.

Realizar a PCR de acordo com as condições encontradas no protocolo de texto e obter o limiar do ciclo ou os valores de CT. Calcule delta CT vezes a quantidade CT elevado a ZY um menos CT elevado a BCL dois e os níveis de expressão ZY um ou dois elevado a menos delta CT geram curvas padrão plotando a média do triplicado dois elevado à potência dos valores delta CT para a porcentagem conhecida de DNA masculino na mistura com um ajuste de regressão linear mostrado. Aqui estão exemplos de curvas padrão plotadas com valores médios de dois elevado à potência do delta CT em relação às porcentagens de DNA masculino.

Este gráfico inclui uma temperatura de fusão específica para os amplicons BCL dois e ZFY um localizados em 78,5 e 88,5 graus Celsius, respectivamente. O BCL dois é usado como um gene de referência para normalizar a quantidade total de DNA carregado em cada reação de PCR. BCL duas curvas de amplificação para cada amostra padrão se fundem independentemente da concentração de DNA masculino, indicando quantidades iguais de DNA carregado.

No entanto, as curvas de amplificação ZFY um migraram para a esquerda com quantidades crescentes de DNA masculino na amostra de células-tronco hematopoiéticas de camundongos PIM TKO têm defeitos na reconstituição de camundongos letalmente irradiados e, como esperado, os camundongos receptores transplantados com células PIM TKO tiveram uma porcentagem muito menor de células masculinas em comparação com camundongos transplantados com células do tipo selvagem. Para validar nosso método, testamos o enxerto de células de doadores machos em camundongos fêmeas transplantados, recebendo células da medula óssea do tipo selvagem versus camundongos PIM triplo knockout ou TKO em diferentes momentos pós-transplante, tanto sangue periférico em seis semanas quanto amostras de medula óssea em 16 semanas. Foram analisados Depois de assistir a este vídeo.

Você deve ter um bom entendimento de como usar o método baseado em PCR para quantificar o enxerto de células doadoras em um modelo competitivo de transplante de medula óssea marinha.