Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

O objetivo geral do procedimento a seguir é testar rapidamente a atividade enzimática extracelular microbiana em uma variedade de ambientes naturais. Isso é obtido adicionando amostras de lamas de água ou solo à microplaca para produzir replicação adequada Como segunda etapa, substrato colormétrico ou fluorométrico artificial é adicionado aos poços de microplacas, o que permite a ocorrência de reações enzimáticas. Em seguida, a absorbância ou fluorescência é medida para determinar a quantidade de produto final liberada durante a reação.

Os resultados mostram diferenças na atividade enzimática extracelular entre as amostras com base na absorbância ou fluorescência da reação final. Hoje vamos demonstrar como medir a atividade enzimática extracelular em ambientes naturais. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em ecologia microbiana, como taxas de água no processamento de matéria orgânica e mineralização de nutrientes em solos, sedimentos e águas Geralmente, os indivíduos novos no uso desse método terão dificuldades devido à dificuldade em separar as partículas da solução de reação, especialmente ao analisar um grande número de amostras.

Uma demonstração visual desse procedimento é fundamental, pois o layout da placa pode ser difícil de aprender e fazer medições em várias etapas de tempo pode tornar esse procedimento mais desafiador. A análise métrica da atividade enzimática extracelular para solos e sedimentos começa com a preparação do tampão substrato e soluções padrão conforme descrito no protocolo de texto para solo, prepare uma pasta de cada amostra para ser analisada em um tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros. Adicionar uma concentração de cerca de um grama por mililitro utilizando tampão acetato 50 milimolar para sedimentos.

Adicione tampão de acetato suficiente para tornar a pasta facilmente pipeada. O volume exato de pasta necessário varia de acordo com o número de enzimas analisadas, mas recomenda-se um mínimo de cinco mililitros. Vortex cada pasta até que todos os aglomerados de solo ou sedimento tenham se dispersado.

E observe o volume final. Corte a extremidade das pontas da pipeta com uma tesoura antes de pipetar. Como as lamas do solo tendem a entupir as pontas, rebata cada pasta e pipete imediatamente 150 microlitros em cada um dos seis poços.

Em um bloco de poço de 96 poços de profundidade. É importante fazer vórtice de forma completa e frequente. Para manter as partículas do solo em suspensão, deixe pelo menos dois poços por bloco vazios para servir como controle de substrato.

Prepare 1 96. Bloco de poço para cada enzima a ser testada. Despeje aproximadamente cinco mililitros de tampão de acetato em um reservatório de pipeta e use um pipetador de oito canais para adicionar 150 microlitros do tampão aos dois últimos poços de cada amostra.

Para os controles de tampão de amostra e para os dois poços de controle de substrato. Despeje aproximadamente 10 mililitros da solução apropriada de nitro erva-doce ou substrato PNP em um reservatório de pipeta e use uma pipetadora de oito canais para adicionar 150 microlitros da solução de substrato aos primeiros quatro poços de cada amostra e aos dois poços de controle de substrato. Observe o tempo em que a reação começa, assim que a solução de substrato é adicionada.

Incube as placas em temperatura ambiente por 0,5 a quatro horas. O tempo exato de incubação varia de acordo com o nível de atividade nas amostras e a enzima a ser analisada. Enquanto os ensaios estão incubando, prepare uma microplaca transparente de 96 poços.

Para cada bloco de poço profundo, a fim de ler a pipeta de absorbância, 190 microlitros de água destilada e 10 microlitros de hidróxido de sódio molar em cada poço da microplaca. O hidróxido de sódio retarda a reação enzimática e aumenta o pH, o que realça a cor do PNP liberado durante a reação após a incubação. Centrifugue os blocos de 96 poços a 2000 a 5.000 vezes G por cinco minutos para pellet de partículas de solo.

A remoção do líquido sem perturbar o pellet pode ser um desafio. Deve-se evitar o uso de muita amostra de solo inicialmente. Certifique-se de centrifugar por tempo suficiente e use um movimento cuidadoso, mas confiante, para retirar o líquido.

Use uma pipeta multicanal para retirar 100 microlitros de cada um. Bem, tomando cuidado para evitar o pellet. Transfira o líquido para o poço correspondente em uma microplaca clara preparada de 96 poços, ligue o leitor de microplacas e configure qualquer absorbância de registro de software necessária em 410 nanômetros após a determinação da massa seca das amostras conforme descrito no protocolo de texto, calcule a absorbância final de cada amostra subtraindo a absorbância de controle da amostra da absorbância do ensaio da amostra.

Se os controles de substrato tiverem alta absorbância superior a 0,060, subtraia-os. Prossiga também para calcular a atividade enzimática em micromoles por hora por grama de massa seca usando esta equação. Depois de organizar uma microplaca preta para cada enzima seguindo o exemplo mostrado no protocolo de texto, despeje aproximadamente cinco mililitros da primeira amostra de água em um reservatório de pipeta e use um pipetador de oito canais para pipetar 200 microlitros em todos os poços.

Na coluna um da microplaca, descarte as pontas de pipeta usadas e repita conforme necessário para cada amostra de água para preencher as colunas de um a nove. Configure controles para contabilizar amostras, padrões, substrato e têmpera na mesma microplaca preta que as amostras. Os controles de amostra contêm água de amostra e tampão de bicarbonato e não são usados nos cálculos de atividade, mas demonstrarão consistência de leitura ao longo do experimento.

Os controles de têmpera consistem em água de amostra e uma quantidade padrão da etiqueta fluorescente e são usados para medir a difração da fluorescência. Na água de amostra, o substrato e os controles padrão são compostos de substrato ligado ou da etiqueta fluorescente padrão, respectivamente, e tampão de bicarbonato. Despeje aproximadamente cinco mililitros de tampão de bicarbonato de cinco milimolares em um reservatório de pipeta limpo.

Pipete 50 microlitros de tampão nos poços de microplacas de um a nove nas fileiras d e e para formar dois, replique os poços de controles de amostra por ponta de pipeta de troca de amostra e, em seguida, transfira 200 microlitros de tampão de bicarbonato para os poços 10 a 12 nas fileiras A e H. Embora a luz seja mantida brilhante nesta demonstração para fins de filmagem, A iluminação ambiente deve ser reduzida escurecendo ou desligando as luzes, pois o padrão fluorescente é sensível à luz. Despeje aproximadamente cinco mililitros de 10 micromolares, quatro metil mona ou MUB em um reservatório de pipeta limpo, pipete 50 microlitros em poços de microplacas de um a 12 na linha H. Em seguida, pipete 50 microlitros em poços de um a nove nas linhas G e F para formar três réplicas de controles de têmpera por amostra e controles padrão gerais. Coloque a microplaca no escuro ou cubra com uma tampa opaca para reduzir a degradação da luz do MUB, ligue o fluorímetro e configure qualquer software necessário para estar pronto para ler antes de adicionar o substrato.

Para aproximadamente cinco mililitros do substrato revestido com MUB apropriado em um reservatório de pipeta limpo, use um pipetador de 12 canais para pipetar 50 microlitros nos poços de microplacas de um a 12 na linha A e nos poços de um a nove nas linhas B e C para formar três, ensaios de replicação para cada amostra e três controles de substrato procedem imediatamente ao registro de fluorescência. Leia a fluorescência inicial imediatamente após a adição do substrato à microplaca após a leitura. A fluorescência incuba a microplaca à temperatura ambiente, seja no escuro ou coberta com uma tampa opaca.

Para reduzir a degradação da luz do MUB. O tempo de incubação necessário para medir a atividade enzimática potencial máxima dependerá da concentração enzimática dentro de uma amostra. Como isso é desconhecido, antes que a amostra seja analisada, uma microplaca terá que ser lida em várias etapas.

Para a maioria das enzimas, intervalos de 10 a 15 minutos ao longo de uma hora são apropriados, embora algumas amostras com altas concentrações atinjam o pico antes de 10 minutos. Continue lendo fluorescência na microplaca nos intervalos designados por pelo menos uma hora. Certifique-se de manter a microplaca coberta ou no escuro entre as leituras.

Para cada amostra, em cada intervalo de tempo, calcular a fluorescência inicial média da amostra, a fluorescência final média da amostra, a fluorescência padrão média e a fluorescência média do controlo de atenuação para cada intervalo de tempo. Calcule a atividade enzimática em m por hora por mililitro. Usando a equação encontrada no protocolo de texto.

Examine os valores de atividade calculados para cada intervalo de tempo, determine a atividade potencial final do intervalo de tempo com a atividade mais alta. Se os valores de atividade continuarem a aumentar, etapas de tempo posteriores poderão ser necessárias. Se os valores de atividade caírem ao longo da execução, execute novamente com intervalos de tempo mais curtos.

Solos e sedimentos aquáticos normalmente têm níveis apreciáveis de atividade enzimática extracelular como resultado de comunidades microbianas ligadas que crescem na superfície das partículas. Esta figura mostra como essa atividade muda dependendo do tamanho das partículas obtidas do sedimento superficial de um riacho de terceira ordem no norte do Mississippi. O estudo anterior da USAA mostrou que as comunidades bacterianas nas partículas de sedimentos desse fluxo podem ser separadas em três grupos distintos com base na análise molecular de sua estrutura comunitária.

Aqueles em partículas de 0,063 milímetros, aqueles em partículas de 0,1, 2, 5, 0, 0,25 e 0,5 milímetros e aqueles em partículas de um milímetro. A análise dos padrões na atividade enzimática extracelular apóia essa conclusão, com a fosfatase sendo semelhante em partículas de 0,1, 2, 5, 0,25 e 0,5 milímetros, mas muito maior nas frações de um e 0,063 milímetros quando medida usando a técnica de substrato ligado a PNP. Outras enzimas, como beta glucco e n AGAs, mostram picos semelhantes nas partículas mais finas, mas não são elevadas em partículas de um milímetro.

Destacando o fato de que diferentes enzimas podem apresentar diferentes distribuições ambientais e estas podem ser elucidadas usando este ensaio. As barras de erro relativamente baixas mostram que os ensaios métricos de chole da atividade enzimática em sedimentos são reprodutíveis e, portanto, passíveis de análise estatística. Ao comparar amostras diferentes e ambientais, as águas naturais tendem a ter menor atividade enzimática extracelular por mililitro do que solos ou sedimentos por grama.

Como tal, eles devem ser testados metricamente a flora usando substratos ligados ao MUB. Esta figura mostra como a atividade das enzimas, fosfatase, beta, glucco e NGAs varia com a profundidade. Em um lago raso no norte do Mississippi, EUA, o lago é conhecido por ser pobre em nutrientes, o que também é sugerido pela atividade relativamente alta de fosfatase e enzima que os microrganismos produzem para adquirir fosfato de compostos orgânicos.

Para todas as três enzimas, as amostras de ensaio coletadas na superfície da água e a 50 centímetros de profundidade mostraram atividade semelhante. Enquanto a atividade foi elevada na amostra de 100 centímetros, a amostra foi essencialmente retirada da interface sedimento aquático e a presença de partículas de sedimento na amostra provavelmente é responsável pela maior atividade observada na amostra, especialmente para beta glucco e n AGAs. Tal como acontece com os substratos PNP, as barras de erro baixas mostram que, mesmo com apenas três leituras replicadas, a reprodutibilidade dos ensaios fluorométricos usando substratos MUB é alta.

Observe que as unidades para a atividade enzimática da amostra de água são inal do substrato consumido, enquanto aquelas para a atividade enzimática nas partículas do sedimento estão em micromoles do substrato consumido, embora o tamanho por unidade seja comparável. Isso destaca o fato de que solos e sedimentos tendem a ter atividade extracelular muito maior do que as águas naturais. Também demonstra o aumento da sensibilidade da técnica de substrato ligado ao MUB e a necessidade de usar essa técnica para testar a atividade enzimática extracelular em amostras de água, uma vez dominada.

Esta técnica pode ser usada para testar nove amostras de água para até enzimas em pouco mais de uma hora ao tentar este procedimento para solos e sedimentos. É importante usar um material maciço conhecido para que a atividade possa ser expressa com base no peso seco. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a atividade enzimática extracelular e uma variedade de ambientes naturais usando técnicas métricas de cores ou métricas inferiores.