Geração de cisalhamento Adesão Mapa Usando SynVivo Networks microvasculares sintético

O objetivo geral do experimento a seguir é obter um mapa de adesão pura da adesão de partículas celulares de um único experimento usando redes microvasculares sintéticas. Isso é conseguido primeiro revestindo o dispositivo microfluídico com a proteína de interesse, neste caso avadon. Como segunda etapa, partículas biotiniladas são injetadas no dispositivo em taxas de cisalhamento fisiológicas, que se ligam ao dispositivo revestido com avadon com padrões diferenciais dependendo das taxas de cisalhamento locais.

Em seguida, o número de partículas ligadas é contado para gerar um mapa de adesão pura das partículas usando um banco de dados criado computacionalmente de valores de taxa pura na rede. Os resultados mostram que um mapa de adesão puro pode ser obtido a partir de um único experimento, resultando em economia significativa de tempo e reagentes em comparação com as câmaras de fluxo de placas paralelas convencionais. A principal vantagem dessa tecnologia sobre os métodos existentes, como canais de fluxo linear, é que podemos gerar mapas compartilhados a partir de um único experimento, resultando em uma economia significativa de custo e tempo.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da entrega de medicamentos, como a capacidade dos veículos de entrega de medicamentos de se ligarem aos alvos desejados. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando estávamos usando câmaras de fluxo de placa de pá para entender a lesão celular específica. Sob condições fluidas, no entanto, o foco deste ensaio é fornecer informações básicas sobre a partícula s e a adesão celular.

A plataforma syn vivo pode ser aplicada a uma variedade de outros sistemas, como câncer e entrega do SNC, infecção e inflamação, trombose e disfunção da microcirculação. A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas do dispositivo microfluídico são difíceis de aprender, acostumando-se a pequenos volumes de amostra e as melhores práticas para evitar a formação de bolhas são melhor comunicadas visualmente. Demonstrando o procedimento estará Ashley Smith, uma cientista pesquisadora de nosso laboratório.

O dispositivo microfluídico SynVivo SMN é composto por dois conjuntos de portas paralelas, uma para fluir no revestimento da superfície, porções e/ou células para assentamento, e a outra para executar o ensaio. Para começar, mergulhe completamente o dispositivo em uma placa de Petri contendo água deionizada estéril e coloque a placa no vácuo. Dessecar permite que o dessecador funcione até que todo o ar seja removido dos canais do dispositivo.

Isso deve levar aproximadamente 15 minutos antes de remover o dispositivo da água. Use uma pinça de ponta fina para colocar tubos tigon preparados com água em cada porta do dispositivo. A tubulação deve ter aproximadamente uma polegada de comprimento.

O dispositivo agora pode ser removido da água usando uma pipeta ou seringa. Coloque uma gota de água ao redor da base de uma tubulação da porta de entrada. Remova cuidadosamente a tubulação.

A gota de água impedirá a entrada de ar no dispositivo. Em seguida, prepare uma seringa de um mililitro carregada com avadon a uma concentração de 20 microgramas por mililitro. Conecte a seringa a uma agulha e tubo de aço inoxidável de calibre 24 Clamp a porta de entrada que não está sendo utilizada com uma mandíbula clamp.

Insira a tubulação na porta de entrada do dispositivo. Injete avadon a um débito de um microlitro por minuto durante 10 minutos para permitir a perfusão completa do dispositivo. No final do tempo de fluxo.

Prenda toda a tubulação com braçadeiras de mandíbula e coloque o dispositivo a quatro graus durante a noite. Deixe o dispositivo atingir a temperatura ambiente. Em seguida, coloque o dispositivo em um microscópio de fluorescência invertida equipado com uma platina motorizada e uma câmera de alto desempenho.

Preparar uma solução de duas partículas biotiniladas de mícrons a uma concentração de 5 milhões de partículas por mililitro em tampão fosfato salino ou PBS. Coloque as partículas em uma seringa de um mililitro. Prepare uma segunda seringa de um mililitro de PBS.

Coloque apenas cada seringa em uma bomba de seringa e, em seguida, conecte-as à agulha e ao tubo usando uma seringa de pipetador. Coloque uma gota de água ao redor da base da tubulação da porta de entrada e remova cuidadosamente a tubulação usada para revestir o dispositivo. Insira cuidadosamente a tubulação para partículas biotiniladas e para PBS em cada uma das portas de entrada.

Em seguida, comece a injetar partículas biotiniladas a uma taxa de fluxo de 2,5 microlitros por minuto. Monitore a porta de entrada no microscópio ao primeiro sinal de partículas. Inicie o cronômetro e continue o fluxo por três minutos.

Ao final dos três minutos, pare o fluxo de partículas biotiniladas e, ao mesmo tempo, inicie o fluxo de PBS a uma taxa de fluxo de 2,5 microlitros por minuto. Deixe o PBS fluir no dispositivo por três minutos para lavar as partículas não ligadas. Para iniciar a aquisição, use a função de varredura de imagem grande no software de imagem para adquirir a imagem de todo o dispositivo e, em seguida, numere sequencialmente as bifurcações no dispositivo e crie uma área circular de interesse com o dobro do diâmetro dos canais.

Nesse caso, defina o diâmetro da área de interesse para 200 mícrons, pois o diâmetro do canal é de 100 mícrons. Use a função de contagem automatizada no software de imagem para exportar o número de partículas em cada área de interesse para uma planilha. Da mesma forma, use o recurso de conta automatizada para exportar o número de partículas em todo o dispositivo.

As simulações de CFD são executadas e os resultados são armazenados em um banco de dados para análise posterior. As informações incluídas nos resultados contêm taxas de cisalhamento da parede, velocidade, fluxo de partículas e aderência ao dispositivo. As informações aqui são usadas para determinar o número de partículas que aderem em cada área de interesse, dada uma entrada definida de uma concentração de partícula.

Para gerar um mapa de adesão de cisalhamento, calcule a porcentagem de adesão conforme detalhado no protocolo de texto como uma etapa final. Plote o mapa de adesão pura usando a taxa pura em cada bifurcação das redes e os valores percentuais de adesão. Esta imagem mostra um dispositivo SMN syn vivo revestido com avidan típico após a ligação de duas partículas biotiniladas de mícron.

Observe que as partículas aderem preferencialmente perto das bifurcações na rede. As bifurcações numeradas na rede SMN syn vivo podem ser vistas aqui. Esta imagem é o exemplo de mapa de cisalhamento de parede gerado pelo modelo CFD do dispositivo.

A taxa de cisalhamento varia no dispositivo, variando de 250 segundos inversos a 15 segundos inversos, conforme observado na microvasculatura in vivo. Observe que essas taxas de cisalhamento variáveis não podem ser obtidas simultaneamente em canais microfluídicos lineares, pois fornecem uma taxa de cisalhamento constante para cada taxa de fluxo. O gráfico mostrado aqui dos valores da taxa de cisalhamento em cada uma das bifurcações da rede revela que os padrões de taxa de cisalhamento são complexos e não podem ser obtidos com uma relação analítica simples, ao contrário dos canais de fluxo lineares.

Além disso, várias bifurcações estão presentes na rede que caem na mesma caixa. Aumentando a confiança estatística dos dados mostrados. Aqui estão os resultados de amostra da análise CFD para fluxos de partículas na rede, que são usados para calcular os fluxos de partículas nas ramificações e bifurcações da rede experimental.

O mapa de adesão pura calculado a partir de um único experimento SMN syn vivo segue a relação inversa observada a partir de mapas de adesão pura obtidos de experimentos de canal linear. No entanto, usando um ensaio SynVivo, um único experimento permite a geração desse mapa puro, enquanto várias execuções experimentais são adquiridas dos canais lineares. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar os dispositivos SynVivo SMN para gerar a adesão compartilhada a partir de um único experimento.

Ao realizar este experimento, é importante lembrar de não introduzir bolhas no dispositivo microfluídico SynVivo SMN após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da inflamação estudarem a interação do endotélio leucocitário em diferentes taxas em um único experimento. Na próxima geração de dispositivos, os pesquisadores podem estudar a adesão e migração de rolamento de leucócitos em um único ensaio, algo que atualmente não é possível.

Após este procedimento, outros métodos que investigam a adesão de medicamentos, veículos de entrega de medicamentos e células podem ser realizados para investigar questões como o efeito fisiológico do fluxo na célula celular, adesão de medicamentos celulares e veículos de medicamentos.