Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

O objetivo geral deste procedimento é recuperar partículas virais infecciosas produzidas inteiramente a partir de um cDNA clonado de vírus de RNA de fita positiva, cujos genomas apresentam a mesma polaridade que o mRNA celular, como o vírus da encefalite japonesa. Essa genética reversa baseada em cDNA é um método fundamental que permite a manipulação direta do RNA genômico viral, gerando assim vírus recombinantes para estudos moleculares e genéticos da replicação viral e da patogênese. Essa técnica também fornece uma plataforma valiosa que permite o desenvolvimento de vetores virais de vaccinia geneticamente definidos para a entrega de genes estranhos.

Esses métodos são aplicáveis à clonagem de cDNA de comprimento completo para vírus de RNA de fita negativa ou positiva, particularmente aqueles com genomas maiores que 10 kb. Demonstrando o procedimento estarão vários membros do meu laboratório: a assistente de pesquisa Sang-Im Yun, os pesquisadores pós-doutorandos Byung-Hak Song e Jin-Kyoung Kim e o estudante de graduação Jordan Frank.

A parte em vídeo desta publicação abrange a preparação do cromossomo artificial bacteriano contendo as sequências de interesse, a síntese de RNA transcrito a partir do plasmídeo original e como medir a infectividade do RNA e o rendimento viral. Todos os procedimentos utilizados antes da geração do plasmídeo BAC são fornecidos no protocolo textual com grande detalhe. Para este procedimento, primeiramente cultive uma única colônia de E. coli DH10B, carregando o plasmídeo BAC, em três mililitros de caldo 2X YT com cloranfenicol. Incube a cultura por 10 horas a 35 graus Celsius com agitação entre 225 e 250 rpm.

Após 10 horas, aumente a escala do cultivo. Em seguida, inocule 500 microlitros de crescimento em 500 mililitros de meio e cultive o inóculo por seis horas com agitação vigorosa. Após seis horas, centrifugue o cultivo bacteriano em 2 frascos de 250 mililitros a 3.100 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, re-suspenda cada pellet em 30 mililitros de solução GTE.

Adicione 500 microlitros de lisozima e incube as suspensões em gelo por 10 minutos. Enquanto isso, prepare uma solução de lise fresca para o próximo passo. Após 10 minutos, adicione 60 mililitros da solução de lise e misture por inversão até que a solução fique aparentemente clara.

Deixe as reações ocorrerem à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, adicione 45 mililitros de solução de neutralização a cada frasco e inverta os frascos até que estejam completamente misturados. Depois, coloque-os sobre gelo por 10 minutos.

Colete os lisados neutralizados com centrifugação refrigerada de alta força g. Em seguida, transfira os sobrenadantes para dois novos frascos de 250 mililitros. Adicione 0,6 volumes de isopropanol a 100% a cada um e coloque-os no gelo por 20 minutos.

Em seguida, centrifugue os precipitados, descarte os sobrenadantes e dissolva os pellets em cinco mililitros de tampão TE. Combine os dois volumes em um único tubo de 50 mililitros e precipite o RNA adicionando um volume igual de cloreto de lítio 5 M e incubando a mistura em gelo por 10 minutos. Utilize uma centrifugação fria de 20 minutos para coletar o precipitado de RNA.

Em seguida, transfira o sobrenatante para um novo tubo de 250 mililitros, adicione dois volumes de isopropanol a 100% e coloque o tubo no gelo para que o precipitado de DNA se forme. Após 20 minutos, centrifugue para sedimentar o precipitado, aspire o sobrenatante, reconstitua o pellet de DNA em 9,5 mililitros de tampão TE e transfira a solução de DNA para um tubo de 50 mililitros.

Continue o preparo montando o gradiente de cloreto de césio com brometo de etídio. Carregue a mistura em um tubo de polipropileno vedável usando uma seringa com agulha de 18 fios e feche o tubo. Gire o tubo fechado durante a noite em uma ultracentrífuga para formar um gradiente de cloreto de césio.

No dia seguinte, colete uma faixa de DNA do plasmídeo BAC a partir do gradiente de cloreto de césio. Use uma agulha de 18 gauge para criar uma ventilação de ar no topo do gradiente e uma agulha de 20 gauge com seringa para coletar o DNA BAC da lateral do gradiente, e então transfira a coleta para um tubo microfuge de 1,7 mililitro. Realize uma lavagem, adicione 2,5 volumes de butanol saturado com água e misture com vortexagem normal.

Em seguida, centrifugue a mistura à temperatura ambiente e transfira a fase aquosa inferior para um novo tubo microcêntrifuga de 1,7 mililitro. Repita essa lavagem um total de seis vezes para remover todo o brometo de etídio. Agora, precipite o DNA BAC. Adicione um décimo do volume de acetato de sódio 3 molar e 2,5 volumes de etanol 100% ao tubo. Incube a mistura em gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue o precipitado à temperatura ambiente e lave o pellet de DNA com um mililitro de etanol 70%. Repita a centrifugação e colete o pellet novamente. Por fim, seque o DNA em pellet ao ar por 10 minutos e elua-o em 200 microlitros de tampão TE.

Inicie com uma digestão em larga escala por enzima de restrição do plasmídeo BAC com Xba-one em um volume total de 100 microlitros. Realize esta digestão a 37 graus Celsius por 12 a 15 horas. Em seguida, incube a digestão adicionalmente com mais 25 unidades de nuclease de feijão-mungo a 30 graus Celsius por duas horas.

Após a incubação, complete o volume até 300 microlitros com água destilada. Em seguida, realize uma extração com fenol adicionando um volume igual de fenol-clorofórmio, álcool isoamílico à amostra diluída, agitando vigorosamente em vórtex por um minuto, centrifugando o tubo e transferindo a fase aquosa superior para um novo tubo.

Em seguida, repita a extração com clorofórmio. Depois, recupere o DNA BAC linearizado por precipitação com etanol. Colete o pellet de DNA por centrifugação, descarte o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de etanol a 70%. Repita a etapa de centrifugação e seque o pellet ao ar. Após 10 minutos de secagem, dissolva o pellet de DNA em 30 microlitros de água destilada. Em seguida, analise um microlitro do BAC recuperado em um gel de agarose a 0,8%.

Em seguida, monte uma transcrição de runoff de 25 microlitros do DNA BAC linearizado, incluindo UTP tritiado para quantificação de RNA. Realize a reação a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, analise um ou dois microlitros da reação de transcrição de runoff em um gel de agarose 0,6%.

Inicie com células BHK-21 cultivadas por 24 horas em placas de 150 milímetros, semeadas a 3 milhões de células por placa. Lave a monocamada celular com a solução fria A e, em seguida, desprenda-as por tripsinização. Colete as células por centrifugação a 270 ×g durante dois minutos.

Em seguida, ressuspender as células em 50 mililitros da solução A fria e centrifugar novamente. Repetir esta lavagem três vezes. Após a última lavagem, ressuspender as células a 20 milhões por mililitro na solução A. Em seguida, misturar uma alíquota de 400 microlitros da suspensão celular com dois microgramas de RNA sintético em uma cubeta de dois milímetros.

Eleptroporar imediatamente a mistura em condições ideais e deixar as células em repouso por 10 minutos. Em seguida, transferir as células para um tubo microcêntrifuga contendo 600 microlitros de meio de cultura completo. Preparar agora diluições seriadas de dez vezes das células eletroporadas em volumes de um mililitro. Semear alíquotas de 100 microlitros de cada diluição sobre monocamadas de células BHK21 normais. Após quatro a seis horas de incubação, recobrir as células com agarose a 0,5% em MEM acrescido de FBS e cultivá-las por mais quatro dias.

Células BHK21 foram submetidas a eletroporação simulada ou eletroporadas com transcritos de RNA derivados de dois clones independentes do JEV-BAC de comprimento completo. Quatro dias depois, as células foram coradas com violeta cristal para visualizar o RNA infeccioso nas células. Por meio dessa coloração, os centros infecciosos foram quantificados. Em seguida, a expressão de proteínas virais foi examinada em células eletroporadas com RNA 20 horas após a transfeção, utilizando soro anti-NS-um coelho e um anticorpo secundário conjugado com Cy3, visível em vermelho. Os núcleos foram contra-colorados com DAPI, visível em azul. Posteriormente, em 22 e 40 horas após a transfeção, a produção de viriões infecciosos acumulados nos sobrenadantes de cultura das células eletroporadas com RNA foi analisada por ensaios de placa.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como resgatar um vírus infeccioso inteiramente a partir de um cDNA clonado de uma cepa positiva de RNA, como o vírus da encefalite japonesa. Portanto, não se esqueça de que trabalhar com o vírus da encefalite japonesa e outros patógenos humanos pode ser extremamente perigoso. É necessária uma adequada capacitação em biossegurança antes de realizar este procedimento.