Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral

O objetivo geral do experimento a seguir é estudar a dinâmica transcricional e os núcleos cerebrais definidos de camundongos após a experiência comportamental. Isso é conseguido primeiro habituando os animais e registrando sua atividade locomotora após a injeção de solução salina. Uma vez habituada, a atividade locomotora é registrada após uma única dose de cocaína, amostras do núcleo accumbens são coletadas e usadas para isolamento de RNA e preparação de CDNA.

Em seguida, a análise de QPCR é realizada para estudar a expressão gênica induzida pelo comportamento. Em última análise, são obtidos resultados que mostram a dinâmica transcricional após a experiência com cocaína Demonstrando o protocolo estarão o Dr. Hatu, o gerente do laboratório, Dum Muer, um estudante de pós-graduação do laboratório e Duran, um estudante de graduação do laboratório por três dias consecutivos. Cada camundongo é habituado aos procedimentos de manuseio e injeção, organizou os camundongos em gaiolas antes de iniciar o experimento, de modo que os camundongos não sejam transferidos entre gaiolas no futuro e os camundongos nunca sejam deixados isolados por um longo período de tempo.

30 minutos antes do início dos testes, todas as gaiolas de teste devem ser transferidas para a sala comportamental para permitir que os animais se adaptem ao ambiente. Administre uma injeção intraperitoneal de 250 microlitros de solução salina imediatamente após a injeção, coloque o camundongo em uma câmara de comportamento para monitorar a atividade locomotora por 15 minutos. O rato pode ser colocado na câmara de comportamento por 20 minutos.

Uma atividade monitorada do segundo ao 17º minuto. Repita essas etapas na mesma hora do dia nos dois dias seguintes. No quarto dia, administre uma única injeção de cocaína ou solução salina, dependendo do grupo, e coloque imediatamente o camundongo na câmara para monitorar a atividade motora local por 20 minutos em pontos de tempo selecionados após a exposição à cocaína, extraia o cérebro e coloque-o em uma solução gelada, Uma solução de LCR por um a dois minutos para esfriar e endurecer.

Depois de remover o cerebelo e absorver o excesso de líquido, cole o cérebro ao estágio de um vibram com a parte rostral voltada para cima. Encha a câmara com LCR A gelado e corte cortes de 200 mícrons até que o núcleo accumbens esteja claramente identificado. Preste muita atenção à forma do corpo caloso, à localização e forma da comissura anterior e dos ventrículos durante o corte.

Uma vez identificada a região correta, corte duas seções de 400 mícrons das quais o núcleo accumbens será dissecado sob um estereoscópio. Use uma lâmina fina para dissecar o núcleo accumbens longe das fatias. Quatro passagens rápidas da lâmina na área correta devem isolar o tecido apropriado imediatamente.

Coloque o tecido isolado em 900 microlitros de reagente de lise e armazene a 80 graus Celsius negativos até a extração de RNA para começar a descongelar os tubos a 37 graus Celsius e homogeneizar. Usando uma agulha de calibre 25, as primeiras rodadas podem ser difíceis e exigir empurrar o tecido contra a parede do tubo para homogeneizá-lo em pequenos pedaços. Para garantir a homogeneização adequada, pipetar o lisado em uma mini coluna de centrifugação trituradora kaya e centrífuga.

Pipetar o lisado para um novo tubo de microcentrífuga e extrair o RNA de acordo com as instruções do fabricante. Após a purificação do RNA, é realizada a transcrição reversa para CDNA, bem como a amplificação preem específica do alvo das amostras com primers direcionados contra o grupo de genes escolhidos para análise. Esses procedimentos estão descritos na versão em texto do protocolo.

Chips microfluídicos comerciais para análise abrangente de QPCR estão disponíveis em 48 por 48. Formato, permitindo a análise de 48 amostras com 48 conjuntos de sondas, ou em um formato de 96 por 96 em que 96 amostras são analisadas com 96 sondas. Na maioria dos casos, a escolha do chip depende principalmente do número de amostras analisadas.

Primeiro, prepare a mistura de amostras de acordo com o chip escolhido para o experimento. Tenha cuidado ao pipetar o reagente de carregamento de amostra de corante de ligação 20 XDNA. Agitar as soluções de mistura de amostras durante um mínimo de 20 segundos e centrifugar durante pelo menos 30 segundos.

As reações preparadas podem ser armazenadas por curtos períodos a quatro graus Celsius até que o chip esteja pronto para carregamento. Em seguida, prepare a mistura de ensaio, agite bem a mistura de amostra e centrifugue para girar todos os componentes. Como mostrado anteriormente, o chip IFC de matriz dinâmica possui entradas para amostras e ensaios, bem como entradas especificadas para fluido de linha de controle usado para pressurizar as câmaras microfluídicas.

Primeiro, injete fluido da linha de controle em cada acumulador do chip. Em seguida, prepare o chip colocando-o no controlador IFC e executando o script apropriado. Quando o script terminar, remova o chip preparado do controlador IFC e pipete cinco microlitros de cada ensaio.

Misture no chip. Adicione cinco microlitros de cada mistura de amostra em suas entradas e devolva o chip ao controlador IFC usando o software do controlador IFC. Execute o script para carregar as amostras e ensaios no chip.

Quando o script de combinação de carga terminar, remova o chip carregado do controlador IFC. Em seguida, carregue o chip no termociclador e crie uma nova execução de chip que inclua uma análise da curva de fusão. Usando o software termociclador, certifique-se de que as câmaras de reação sejam reconhecidas corretamente e permitam que a reação seja concluída.

Um aumento na atividade locomotora foi aparente após uma única injeção aguda de cocaína. Nesse corte coronal, linhas brancas grossas marcavam a localização dos cortes feitos para definir os limites do núcleo accumbens. Durante a dissecção, as curvas de amplificação de primers direcionados contra CFOs e phos B demonstram que os pares de primers amplificam seu transcrito alvo com aproximadamente 100% de eficiência.

Em cada ciclo, os resultados mostram que a expressão induzida pela cocaína de CFOs e phos B no núcleo accumbens foi maior uma e duas horas após a exposição. Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de próxima geração, podem ser realizados para identificar novos transcritos não caracterizados.