Glutamina Flux imagem usando sensores codificados geneticamente
31 de julho de 2014
Este artigo irá demonstrar como monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas usando FRET. Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos para sensores de glutamina codificados geneticamente.
O objetivo geral deste procedimento é obter imagens do transporte de glutamina por meio de um transportador expresso heterólogo em células vivas usando a primeira transferência de energia de ressonância ou sensores de traste. Isso é feito primeiro cruzando sete células com um sensor de glutamina e um transportador. O sensor consiste em um doador de trastes inserido em uma proteína de ligação à glutamina bacteriana e um aceitador de trastes no terminal C da proteína de ligação à glutamina.
O segundo passo é configurar um sistema de perfusão e obter imagens das células em tempo real usando um microscópio fluorescente invertido. A etapa final é analisar as imagens e visualizar a dinâmica da glutamina. Em última análise, as atividades do transportador em uma única célula podem ser detectadas usando esses sensores de traste.
A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a medição baseada em cromatografia, é que você obtém uma resolução espaço-temporal muito maior. Esta técnica consiste em três partes, transfecção de células com proteínas sensoras, imagens em tempo real e análise pós-experimental Custo. Sete células são usadas neste experimento devido à sua baixa atividade de transporte endógeno de glutamina.
Semeie as células com cerca de 70 a 80% de fluência em DMEM mais 10% de soro cósmico de bezerro ou CCS e 100 unidades por mililitro. Penicilina estreptomicina em um prato de fundo de vidro de oito poços. Incube a 37 graus Celsius, 5% de CO2, 100% de umidade por 24 horas.
Após 24 horas. Substitua o meio de crescimento por DMEM mais 10% CCS sem antibióticos cresça durante a noite a 37 graus Celsius, 5% CO2 100% de umidade no dia da transfecção. Adicione 0,4 microgramas cada um do DNA plasmático que codifica o sensor de glutamina e o trocador de aminoácidos obrigatório marcado m cereja A SCT dois a 50 microlitros de meio livre de soro.
Adicione um microlitro de reagente de transfecção a 50 microlitros de meio livre de soro, misture suavemente e incube em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, misture a solução contendo o DNA com o reagente de transfecção diluído e incube em temperatura ambiente por 20 minutos. Após 20 minutos, adicione delicadamente a mistura do reagente da transfecção em cima das sete pilhas do custo e misture delicadamente balançando a câmara.
Incube por 24 horas a 37 graus Celsius, 5% de CO2 e 100% de umidade após 24 horas. Substitua o meio por DMEM mais 10% CCS mais 100 unidades de estreptomicina de penicilina. Retorne as células à incubadora antes de iniciar a perfusão.
Prepare os tampões de perfusão de A a F seguindo as receitas do manuscrito anexo. Anexe o stop Cox a seringas de 50 mililitros. Feche as torneiras de parada e encha as seringas com as soluções de perfusão.
Abra a torneira de parada por um breve período para preencher o espaço livre na torneira de parada com o buffer. Em seguida, ligue a gravidade de oito canais. Alimente o sistema de perfusão com um lápis de perfusão e selecione o modo manual.
Na opção de função de seleção. Coloque um recipiente de resíduos sob o lápis de perfusão. Para o sucesso deste experimento, é importante configurar a perfusão de forma a minimizar o desvio e o transporte da solução.
Ative manualmente as portas pressionando os números correspondentes e encha os tubos com água. Usando uma seringa de 10 mililitros, feche as portas, coloque as seringas contendo os tampões de A a F nas portas de um a seis do sistema de perfusão e abra as torneiras de parada. Depois disso.
Abra as portas novamente para substituir a água na tubulação pelos amortecedores. A vazão deve ficar em torno de 0,8 mililitros por minuto. Pressione cancelar uma vez no controlador de perfusão para voltar ao menu de funções de seleção.
Alterne para a opção editar programa e digite o protocolo de perfusão indicado nesta tabela. Salve o programa de perfusão. As células são fotografadas 48 a 72 horas após a transfecção.
Lave os poços do prato de fundo de vidro duas vezes com tampão de perfusão A, tomando cuidado para não lavar as células. Coloque o prato com fundo de vidro no palco do microscópio fluorescente. Conecte o sistema de perfusão à câmara.
Se uma câmara aberta for usada, configure outra bomba que remova a solução de perfusão da câmara. Abra o software de imagem do livro de slides. Inicie um novo slide usando a função de foco, encontre células coex expressando o sensor e A SCT dois M cereja usando conjuntos de filtros apropriados.
Ajuste o ganho clicando na guia da câmera e deslizando a barra deslizante em ganho. Além disso, ajuste a configuração do filtro de densidade neutra no menu suspenso do filtro de densidade neutra. Clique em captura de imagem e, na janela de aquisição, especifique os filtros a serem usados.
As imagens serão adquiridas em três canais. Excitação do doador, excitação do doador de emissão do doador, missão de aceitação e missão de aceitação de excitação do aceptivo. Clique no botão de teste para ajustar o tempo de exposição digitando o tempo de exposição desejado na caixa Ao lado das configurações do filtro, todos os três canais precisam ser expostos pelo mesmo período de tempo.
Desenhe uma região de interesse usando a ferramenta de regiões. Selecione lapso de tempo na caixa de tipo de captura. Em seguida, especifique o intervalo e os pontos de tempo para o experimento.
Em seguida, desenhe uma região em uma área sem células fluorescentes para ser usada para subtração de fundo. Clique com o botão direito do mouse na região desenhada e defina-a como plano de fundo. Idealmente, as células que não estão expressando os sensores devem ser usadas como região de fundo para contabilizar a autofluorescência e a fluorescência de fundo detectadas pela câmera.
Selecione o programa desejado na opção selecionar programas de execução de função, alterne para o programa salvo e pressione Enter no controlador de perfusão. O programa agora está carregado e pressionar qualquer tecla iniciará a perfusão para garantir que a perfusão e o experimento de imagem comecem ao mesmo tempo. Clique no botão Iniciar na janela de captura ao mesmo tempo em que pressiona uma tecla no controlador de perfusão.
Aqui são mostrados experimentos típicos de curso de tempo usando células coex expressando os sensores de glutamina a s CT dois e trastes com afinidades de oito milimolares e 100 micromolares. O influxo de glutamina é detectado como a mudança nas taxas de intensidade de fluorescência entre o doador mtfp um e o aceptor Vênus. O influxo de glutamina na presença de alanina também é substrato demonstrado.
As especificidades dos transportadores também podem ser examinadas usando os sensores. Aqui, as células foram pré-carregadas com glutamina e, em seguida, vários aminoácidos foram adicionados ao perfusível extracelular. Oito, como esperado, um ct de dois substratos induziu glutamina flx, enquanto os aminoácidos não substratos não.
A ausência de alterações na eficiência do traste após a adição de um substrato pode ser devido a vários motivos, como a baixa capacidade de absorção do substrato que está sendo testado, conforme mostrado em células que expressam o sensor de oito milimolares ou o sensor de 100 micromolares. Mas isso não expressa o transportador CT dois para confirmar que a mudança na eficiência do traste se deve à mudança real no substrato e não à mudança em outros parâmetros. O mesmo protocolo de perfusão é realizado usando células que expressam um sensor que se espera que esteja saturado sob a condição experimental.
E neste exemplo, a afinidade do sensor é de 1,5 micromolar. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter imagens da dinâmica dos metabólitos usando sensores de traste. Não se esqueça de que a cultura de células deve ser tratada adequadamente seguindo os procedimentos operacionais padrão para que o risco de exposição seja minimizado.
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Visão Geral
Este artigo demonstra o uso de FRET para monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas. Ele discute o planejamento experimental, detalhes técnicos e considerações para análises pós-experimentais utilizando sensores genéticos codificados para glutamina.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Biofísica
Contexto
- A glutamina é um aminoácido essencial envolvido em diversos processos metabólicos.
- O monitoramento da dinâmica da glutamina pode fornecer informações sobre o metabolismo celular.
- Sensores FRET permitem a imagem em tempo real de moléculas biológicas.
- Sensores geneticamente codificados permitem resolução em nível subcelular em células vivas.
Objetivo do Estudo
- Para imaginar o transporte de glutamina em células vivas.
- Para utilizar sensores de FRET para monitorar atividades de transportadores.
- Para analisar a dinâmica da glutamina no nível de célula única.
Métodos Utilizados
- Transfectar células com um sensor de glutamina e um transportador.
- Configurar um sistema de perfusão para imagem em tempo real.
- Utilizar um microscópio fluorescente invertido para obtenção de imagens.
- Analisar imagens para visualizar a dinâmica da glutamina.
Resultados Principais
- Imagem bem-sucedida do transporte de glutamina em células vivas.
- Detecção de atividades de transportadores utilizando sensores FRET.
- Monitoramento em tempo real da dinâmica da glutamina realizado.
- Informações sobre o metabolismo celular fornecidas pelo estudo.
Conclusões
- Os sensores FRET são eficazes para monitorar a dinâmica da glutamina.
- A metodologia permite uma análise detalhada das atividades dos transportadores.
- Essa abordagem pode aprimorar a compreensão dos processos metabólicos em células vivas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A imagem em tempo real do transporte de metabólitos utilizando sensores FRET codificados geneticamente permite a investigação precisa da cinética de transportadores e especificidade de substrato em resolução de única célula. Esta abordagem auxilia na validação de alvos ao fornecer leituras dinâmicas e quantitativas da atividade do transportador em células vivas, reduzindo a ambiguidade mecanicista na fase inicial de descoberta. O método aumenta a confiança preditiva na identificação de compostos líderes ao associar a função do transportador aos estados metabólicos celulares relevantes para modelos de doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a observação direta da atividade do transportador de glutamina, apoiando a validação funcional de transportadores de solutos como alvos terapêuticos.
- Valor Operacional: Fornece dados em tempo real com resolução subcelular que esclarecem a cinética do transportador e a especificidade do substrato, sem necessidade de lise celular ou ensaios de ponto final.
- Valor Preditivo: Facilita a redução de riscos mecanicistas ao confirmar o fluxo mediado pelo transportador sob condições definidas de substrato, aumentando a confiança nas hipóteses de interação com o alvo.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera alterações quantitativas na razão de fluorescência que servem como leituras robustas em tempo real para avaliação da função do transportador em ensaios com células vivas.
- Valor Operacional: Permite o monitoramento padronizado e reprodutível da atividade do transportador sob diferentes condições de perfusão, apoiando a escalabilidade do ensaio para triagem de compostos.
- Prontidão para Triagem: Permite a detecção de perfis de fluxo e inibição específicos ao substrato, preparando o sistema para avaliação dos efeitos de moduladores sobre a atividade do transportador.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Apoia a análise relevante para doenças ao permitir a investigação específica de tipos celulares no transporte de glutamina em modelos que expressam transportadores relevantes.
- Alinhamento Pré-clínico: Fornece leituras dinâmicas do metabolismo que podem se correlacionar com desfechos fenotípicos, apoiando decisões de avanço com ajuste de risco.
- Conhecimento Mecanístico: Ajuda a distinguir efeitos específicos do transportador de alterações metabólicas fora do alvo, aumentando a confiança no alvo durante a validação pré-clínica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método integra-se aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir a avaliação funcional em tempo real de transportadores após a identificação do alvo, orientando a otimização de compostos líderes por meio de perfis dinâmicos de atividade.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre a função de transportadores mediante a visualização do fluxo de substratos em células vivas, esclarecendo seu papel biológico em vias metabólicas.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas em tempo real adequadas para avaliar os efeitos de compostos sobre a cinética e especificidade de transportadores em formato baseado em perfusão.
- Análises: Gera medições de fluorescência ratiométricas que permitem comparar a atividade de transportadores entre diferentes condições, possibilitando triagem orientada por dados.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao fornecer dados de fluxo de metabólitos em contextos celulares relevantes para doenças, apoiando estudos mecanicistas alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma de imagem reutilizável para monitorar a dinâmica de transportadores de aminoácidos em múltiplos alvos e linhagens celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao reduzir a incerteza sobre o mecanismo do transportador e a especificidade do substrato.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e a padronização de ensaios de transportadores por meio de perfusão controlada e imagem em tempo real.
- Valor Estratégico: Aprimora as decisões de avançar ou não avançar ao fornecer dados funcionais e dinâmicos que reduzem os riscos na seleção de alvos no início do processo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos de transportadores com base em perfis de atividade quantitativos e validados em células vivas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular, microscopia de células vivas e detecção de sinal baseada em FRET.
- Depende do acesso a microscopia de fluorescência invertida com conjuntos de filtros para excitação e emissão do doador e do aceptor, e um sistema de perfusão para troca de solução.
- Necessita padronização da eficiência de transfeção, dos níveis de expressão do sensor e da subtração de fundo entre experimentos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes pares transportador-sensor, incluindo ajuste de afinidade e validação de expressão.
- É limitado pela faixa dinâmica do sensor e pelos potenciais efeitos de saturação, os quais devem ser caracterizados para quantificação precisa do fluxo.
