Bacteriana Detecção e Identificação Utilizando sensores eletroquímicos
23 de abril de 2013
Descreve-se um método de ensaio de sensor electroquímico para a detecção bacteriana rápida e identificação. O ensaio envolve uma matriz de sensores funcionalizada com as sondas de DNA para o RNA de captura de oligonucleótidos (rRNA) sequências específicas das espécies ribossomal. Sandwich de rRNA alvo de hibridação com a sonda de captura e uma sonda detectora de peroxidase de rábano ligada ao oligonucleótido de DNA produz uma corrente mensurável amperométrica.
O objetivo geral do experimento a seguir é detectar e identificar bactérias utilizando sensores eletroquímicos. Isso é alcançado primeiramente pela liberação do RNA ribossomal das bactérias, permitindo a hibridização com a sonda detectora fluorada como segundo passo. O RNA ribossomal ligado à sonda detectora é então adicionado ao eletrodo de trabalho, o que permite a hibridização com a sonda de captura na superfície do sensor. Em seguida, permite-se que o conjugado de anti-fluoresceína e peroxidase de rábano-fora se ligue à sonda detectora fluorada.
Por fim, na corrente interferométrica, pode-se obter a intensidade, que é correlacionada ao número de complexos de sonda capturadora ribossomal e sonda detectora de RNA na superfície do sensor. A principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos baseados em cultura é que as bactérias podem ser detectadas e identificadas em cerca de 45 minutos, evitando o tempo de espera prolongado. Para que uma bactéria forme uma colônia visível em uma placa EDGAR, a aplicação dessa técnica melhoraria o manejo das doenças infecciosas.
A detecção precoce de patógenos bacterianos é essencial para a terapia antibiótica direcionada e para a melhoria dos resultados clínicos. Embora este método seja útil para o diagnóstico de doenças infecciosas, ele também pode ser aplicado a outros problemas diagnósticos, como a imunodiagnose. Comece incubando a sonda de captura diluída com hexanoditiol por 10 minutos à temperatura ambiente para garantir que o grupo tiol na sonda de captura seja reduzido, resultando em resultados mais consistentes.
Após a incubação, aplique um fluxo de nitrogênio sobre o ouro. 16 chips de matriz sensorial por cinco segundos para remover qualquer umidade ou partículas. Pequenos volumes de líquido devem ser cuidadosamente aplicados no eletrodo de trabalho da matriz sensorial. A demonstração visual dessa técnica é essencial.
Como a realização adequada das técnicas de pipetagem, lavagem e secagem reduz significativamente a variabilidade entre chips. Em seguida, aplique seis microlitros da mistura de sonda de captura diluída em HDT ao eletrodo de trabalho de todos os 16 sensores do arranjo de sensores e armazene os chips de sensores em uma placa de Petri tampada a quatro graus Celsius durante a noite; no dia seguinte, lave os chips de sensores com água desionizada por dois a três segundos e, em seguida, seque os chips sob fluxo de nitrogênio por cinco segundos. Agora, aplique seis microlitros de solução de atricloridrato de sódio, cloreto de sódio, EDTA e mercaptoetanol ao eletrodo de trabalho de todos os 16 sensores e incube os sensores por 50 minutos em uma placa de Petri à temperatura ambiente.
Para preparar as amostras para o ensaio com sensor eletroquímico. Transfira um mililitro de cultura bacteriana na fase logarítmica de crescimento para um tubo de microcentrífuga e, em seguida, centrifugue as células por cinco minutos a 16.000 ×g. Observe que bactérias patogênicas devem ser manipuladas em capela de biossegurança.
Após remover o snat, aplique uma ponta de pipeta contendo 10 microlitros de hidróxido de sódio um molar ao fundo do tubo de microcentrífuga e pipete para cima e para baixo algumas vezes para ressuspender completamente o precipitado. Após incubação da suspensão à temperatura ambiente por cinco minutos, adicione 50 microlitros de PBS contendo albúmina sérica bovina ou BSA e uma sonda detectora modificada com fluoresceína para neutralizar o lisado bacteriano. Em seguida, incube o lisado neutralizado por 10 minutos à temperatura ambiente.
Inicie este passo lavando a solução de mercaptoetanol de um dos chips de sensor preparados com água deionizada por dois a três segundos. Após secar o chip conforme demonstrado anteriormente, aplique quatro microlitros do lisado bacteriano neutralizado aos eletrodos de trabalho. 14 dos sensores.
Em seguida, aplique quatro microlitros do oligonucleotídeo de ligação na solução de PBS acrescida de BSA e sonda detectora modificada com fluoresceína aos dois sensores de controle positivo. Após incubação do lisado e dos sensores de controle positivo por 15 minutos, lave e seque todo o chip sensor como anteriormente. Agora, aplique quatro microlitros de anticorpo anti-fluoresceína conjugado à peroxidase do rábano forrageiro ou HRP em PBS contendo caseína aos eletrodos de trabalho de todos os 16 sensores.
Após uma incubação de 15 minutos, lave e seque o chip do sensor. Em seguida, aplique um adesivo de poço de filme sobre a superfície do chip do sensor e carregue o chip no suporte do sensor, pipetando 50 microlitros de substrato TMB sobre os 16 sensores e feche o suporte do chip do sensor. Por fim, utilize um leitor de chip Helios para obter medições de pirometria e telemetria cíclica para os 16 sensores.
O ensaio eletroquímico aqui descrito é estruturado de forma semelhante a um ensaio tipo sanduíche, ELIZA, conforme mostrado nesta figura: a hibridização do RNA ribossomal alvo com as sondas de captura e detecção é revelada por uma reação redox catalisada pela HRP conjugada a fragmentos de anticorpos antifluoresceína que se ligam à ligação tripla de fluoresceína na sonda de detecção. Um componente importante da sensibilidade do ensaio é a química superficial do eletrodo de ouro. O eletrodo de ouro é revestido com mercaptoetanol e hinol e é funcionalizado pela adição de sondas de captura diluídas.
A hibridização em sanduíche do RNA ribossômio alvo com a sonda de captura e a sonda detectora marcada com fluoresceína resulta em um complexo que é detectado pela adição do conjugado de peroxidase do rábano silvestre anti-fluoresceína e do substrato TMB. A corrente paramétrica M é gerada pelo ciclo redox resultante da oxidação do TMB pela peroxidase do rábano silvestre e da redução do TMB pelos elétrons provenientes do eletrodo. Os ensaios demonstrados aqui utilizam um chip de matriz de sensores 16 com fluidos gênicos.
Cada um dos sensores na matriz contém três eletrodos — de trabalho, de referência e auxiliar —, que possuem pontos de contato na borda do chip. O leitor de chip possui pinos tipo pogo que se conectam a cada um desses pontos de contato. O leitor de chip atua como uma interface para a matriz de sensores com um potenciômetro controlado por um algoritmo de computador.
Aqui, são apresentados exemplos do fluxo de corrente em um sensor eletroquímico. O fluxo de corrente nos sensores é artificialmente elevado durante os primeiros segundos após o início das medições paramétricas. Devido ao acúmulo de substrato oxidado no período entre a aplicação de TMB na superfície do sensor e o início do algoritmo do leitor, o fluxo de corrente atinge rapidamente um estado estável, e leituras confiáveis do sensor podem ser obtidas com segurança em até 60 segundos.
A variabilidade entre sensores é relativamente constante, tornando possível realizar 16 ensaios com sensores diferentes em paralelo no chip de matriz de 16 sensores com fluidos genéticos. Controles positivos e negativos são essenciais; como controle positivo, utiliza-se um oligonucleotídeo de DNA de ligação sintético que hibridiza com as sondas de captura e detecção e atua como um alvo sintético de concentração conhecida. Os resultados obtidos com o oligonucleotídeo de ligação funcionam como um controle interno de calibração para minimizar a variação entre chips.
Quanto maior a corrente negativa do eletrodo, maior o sinal. Ao testar as sondas de captura e detecção. O limite de detecção deve ser determinado pela diluição em série de uma amostra de concentração conhecida, conforme mostrado nesta figura, havendo uma correlação linear log-log entre a concentração da amostra e a saída do sinal ao longo da faixa dinâmica do ensaio.
Nestes gráficos de barras, são apresentados os resultados representativos para amostras contendo Escherichia coli e Klebsiella, bem como amônia, substâncias frequentemente encontradas na urina de pacientes com infecção do trato urinário. Os sinais para a maioria dos sensores serão baixos e semelhantes, e esses resultados negativos podem ser agrupados como sinal de fundo. A reatividade com o par de sondas KE distingue Klebsiella de E. coli. O oligonucleotídeo de ligação atua como controle positivo e padrão interno de calibração. Esta técnica pode ser aplicada à detecção de bactérias resistentes a antibióticos em espécimes clínicos mediante a medição da resposta fenotípica das bactérias aos antibióticos.
Essa técnica pode ser utilizada para determinar a terapia ideal para um paciente individual. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como detectar e identificar bactérias comparando as correntes atric em diferentes sensores específicos de espécies no chip.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um método eletroquímico de ensaio com sensor para a detecção e identificação rápidas de bactérias. O método utiliza uma matriz de sensores funcionalizada com sondas de captura de oligonucleotídeos de DNA que visam sequências específicas de RNA ribossomal.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Eletrroquímica
- Microbiologia
- Tecnologia de Sensores
Contexto
- Métodos tradicionais baseados em cultura para detecção bacteriana podem levar mais de 24 horas.
- Técnicas de detecção rápida são essenciais para o manejo eficaz de doenças infecciosas.
- Sensores eletroquímicos oferecem uma alternativa promissora para identificação rápida.
- O RNA ribossômico é um alvo fundamental para detecção específica de espécies.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um ensaio rápido para detecção bacteriana utilizando sensores eletroquímicos.
- Melhorar a velocidade de identificação bacteriana em comparação com métodos convencionais.
- Utilizar o RNA ribossomal como alvo para detecção específica.
Métodos Utilizados
- Liberação de RNA ribossômico de bactérias para hibridização.
- Uso de uma sonda detectora fluorada para ligação com RNA ribossômico.
- Hibridização do RNA ligado à sonda detectora com sondas de captura na superfície do sensor.
- Medição da corrente amperométrica para quantificar a detecção.
Resultados Principais
- O ensaio permite a detecção e identificação bacteriana em aproximadamente 45 minutos.
- A intensidade da corrente amperométrica correlaciona-se com a quantidade de RNA alvo capturado.
- Este método reduz significativamente o tempo necessário para a identificação bacteriana.
- Aplicações potenciais incluem o aprimoramento do manejo de doenças infecciosas.
Conclusões
- O ensaio com sensor eletroquímico é um método rápido e eficaz para detecção bacteriana.
- Essa técnica pode aprimorar o diagnóstico clínico e o manejo de doenças infecciosas.
- Estudos futuros podem expandir a gama de espécies bacterianas detectáveis.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A detecção e identificação rápidas de bactérias em menos de 45 minutos resolvem um gargalo crítico no manejo de doenças infecciosas, permitindo decisões terapêuticas oportunas. Esta abordagem com sensor eletroquímico apoia a validação de alvos ao fornecer detecção específica de espécies por meio de RNA ribossomal com leituras amperométricas quantitativas. O método aumenta a confiança preditiva na fase inicial de descoberta, reduzindo a dependência de ensaios baseados em cultivo, que são lentos, e melhorando a reprodutibilidade do ensaio em uma matriz de 16 sensores.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da hibridização específica de RNA ribossômico e esclarecimento de vias.
- Valor Operacional: Apoia a redução de riscos biológicos ao fornecer validação funcional do alvo por meio de hibridização sanduíche com sondas de captura e detecção.
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva para triagem de portfólio ao fornecer medidas quantitativas atuais correlacionadas com a concentração de RNA alvo.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para fluxos de trabalho subsequentes por meio da funcionalização consistente da superfície do sensor com sondas de captura dilatadas.
- Valor Operacional: Aborda a padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio de calibração interna utilizando controles de oligonucleotídeos ponte para minimizar a variabilidade entre chips.
- Valor Científico: Destaca a prontidão para triagem e a reutilização da plataforma por meio do processamento paralelo de 16 sensores em uma matriz fluidica gênica para avaliação confiável de compostos ou amostras.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Discute a relevância para doenças por meio da detecção de patógenos do trato urinário, como E. coli e Klebsiella, alinhando-se a aplicações translacionais de biomarcadores.
- Valor Operacional: Descreve a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, permitindo a medição rápida da resposta fenotípica a antibióticos para determinação da terapia ideal.
- Valor Científico: Enfoca a desatenção preditiva ao associar leituras eletroquímicas à identificação bacteriana, apoiando decisões de avanço ajustadas ao risco.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Posiciona o método na fase inicial de descoberta até a identificação de compostos líderes, apoiando a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos por meio da detecção específica de rRNA.
- Biologia da Descoberta: Explica como o método apoia o teste de hipóteses e a elucidação de vias por meio da hibridização de RNA ribossômico específico por espécie.
- Triagem: Descreve a prontidão e reprodutibilidade do ensaio por meio de medições quantitativas de corrente amperométrica e controles internos de calibração.
- Análises: Destaca as medições e saídas estatísticas que permitem a comparação de condições entre matrizes de sensores, incluindo a correlação da intensidade do sinal com a concentração do alvo.
- Pesquisa Translacional: Relaciona o método com a continuidade pré-clínica por meio da medição da resposta fenotípica a antibióticos para otimização da terapia.
- Reutilização Empresarial: Apresenta o método como uma capacidade reutilizável por meio do formato de chip com matriz de 16 sensores, permitindo ensaios paralelos e padronização entre plataformas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista na detecção bacteriana.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio do design de matriz de sensores e controles de calibração.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes de prosseguir ou não prosseguir, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados mediante identificação rápida.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em cronogramas de detecção de 45 minutos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em eletroquímica, biologia molecular e química de superfície de sensores para funcionalização de sondas e execução do ensaio.
- Necessita de instrumentação incluindo potenciostato, leitor de matriz de sensores e sistemas de manipulação fluidica para entrega precisa de reagentes.
- Exige padronização entre equipes no design das sondas, protocolos de imobilização e interpretação de dados entre grupos de microbiologia e desenvolvimento de ensaios.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes alvos bacterianos mediante o redesenho das sequências das sondas de captura e detecção com base na variabilidade do rRNA.
- Inclui limitações práticas, como a necessidade de etapas de lise bacteriana e liberação de RNA, as quais podem exigir contenção de biossegurança para amostras patogênicas.
