Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

O objetivo geral do experimento a seguir é realizar o clamp dinâmico in vitro em neurônios corticais usando a caixa de ferramentas de software disponível gratuitamente, LCG. Isso é conseguido preparando fatias de córtex somatossensorial de rato para gravações de patch clamp das células parametálicas. Como segunda etapa, uma série de protocolos eletrofisiológicos automatizados é aplicada à célula registrada, o que fornece uma caracterização padrão da célula que será útil para análises e comparações subsequentes entre os tipos de células.

Em seguida, a injeção de eventos sinápticos excitatórios e inibitórios é simulada. A fim de recriar o alto estado condutor experimentado pelos neurônios neocorticais in vivo, os resultados mostram como a injeção sináptica de fundo modula o ganho das células corticais. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes é a possibilidade de incorporar gravações experimentais em fluxos de trabalho mais complicados, usando, por exemplo, o resultado de um protocolo experimental como entrada para outro protocolo.

Esse método pode ajudar a padronizar protocolos eletrofisiológicos, acelerar a análise de dados e abrir caminho para o compartilhamento de dados entre laboratórios. Embora este método tenha sido originalmente desenvolvido para gravações de CLA de patch por atacado in vitro, ele também pode ser convenientemente usado para outras preparações e protocolos experimentais, como patch in vivo, gravações de CLA ou gravações de acelerador com micro para matrizes da corrida. Depois de extrair o cérebro do rato, descarte o cerebelo e separe os dois hemisférios ao longo da linha média usando um bisturi, remova o excesso de líquido de um dos hemisférios e cole-o em uma plataforma inclinada com uma gota de super cola.

Em seguida, adicione rapidamente algumas gotas de um LCR sobre o cérebro e transfira-o para a câmara Vibram. Remova os primeiros 2,5 a três milímetros do tecido cerebral com uma lâmina. Depois, ajuste a velocidade e a frequência de corte para limitar os danos à superfície do corte.

Em seguida, defina a espessura para 300 micrômetros e comece a fatiar. Depois que a lâmina passar pelo córtex, use uma lâmina de barbear ou uma agulha dobrada para fazer um corte acima do hipocampo e nas bordas da área cortical de interesse. Depois disso, transfira as fatias para uma câmara de incubação de vários poços a 36 graus Celsius.

Neste procedimento, coloque uma fatia na câmara de gravação com a lente de ampliação de 40x. Procure células saudáveis na camada cinco e 600 a 1000 micrômetros. Abaixo da superfície do cérebro, essas células geralmente têm menor contraste, aparência lisa e não estão inchadas.

Assim que uma célula saudável for encontrada, carregue um terço da micropipeta com solução intracelular. Em seguida, coloque-o no estágio principal do sistema operacional Linux pré-configurado. Inicie um comando.

Shell adiciona seu prompt. Digite este comando para garantir que a placa de aquisição de dados não esteja acionando o amplificador. Em seguida, aplique 30 a 50 milibares de pressão positiva pressionando o pistão da seringa, que está conectado ao porta-pipetas.

Em seguida, coloque a pipeta aproximadamente 100 micrômetros acima da fatia e mova a pipeta em direção à célula-alvo usando o modo de aproximação do manipulador microm. Depois disso, ajuste o deslocamento da pipeta no amplificador de eletrofisiologia e emita um pulso de teste de 10 milivolts no modo de grampo de tensão. Usando o comando LCG SEAL teste para monitorar a resistência da pipeta, em seguida, reduza a pressão para 10 a 30 milibares retirando o pistão da seringa.

Aproxime-se suavemente da célula e verifique a formação de uma covinha observando a imagem no monitor da câmera de vídeo. Ao mesmo tempo, monitore um aumento na resistência evocada pelo pulso de teste observando a forma de onda atual exibida no monitor. Quando houver um aumento na resistência da pipeta e a formação de uma covinha na célula, libere imediatamente a pressão e aplique uma leve pressão negativa na pipeta para ajudar na formação da vedação.

Enquanto isso, diminua gradualmente o potencial de retenção para menos 70 milivolts. Aplique uma sucção suave para romper a membrana celular e estabelecer toda a configuração celular. Em seguida, caracterize a célula em termos de suas propriedades elétricas.

Usando o comando LCGE code. Aqui está o potencial de ação médio de um neurônio parametálico da camada cinco remendado com um limiar de 50,5 milivolts negativos. Esta figura mostra a medição das respostas passivas às correntes hiperpolarizantes.

A identificação das propriedades ativas básicas da célula revela que a célula é um neurônio de pico regular e há uma adaptação mínima para injetar potenciais excitatórios simulados e pós-sinápticos no diretório onde o próximo experimento será salvo digitando este comando no prompt de comando do shell. Em vez de agir nos controles de hardware convencionais do amplificador. Para aplicar o balanceamento de ponte e a compensação de capacitância, estime o kernel do eletrodo necessário para realizar a compensação do eletrodo ativo emitindo este comando.

O kernel completo é a soma de dois componentes, um kernel de eletrodo rápido e um kernel de membrana mais lento que dá origem à cauda exponencial observada no kernel completo. O primeiro constitui um modelo não paramétrico da pipeta Após a injeção de corrente para separar os núcleos da membrana e do eletrodo, o comando do kernel LCG solicitará ao usuário o número de pontos que compõem o kernel do eletrodo rápido. Em seguida, selecione um número para que o núcleo do eletrodo cubra o final da cauda de decaimento exponencial.

Em seguida, execute o experimento de grampo dinâmico usando este comando. Por fim, visualize os resultados. Aqui está a recriação de atividades semelhantes in vivo usando grampo dinâmico.

Traços vermelhos e azuis representam a simulação de sinapses excitatórias e inibitórias, respectivamente. E aqui estão os traços de voltagem registrados de um neurônio parametálico L cinco, que foi submetido a um bombardeio de correntes pós-sinápticas excitatórias ou inibitórias. A corrente excitatória, inibitória e total correspondente injetada na célula é mostrada no gráfico.

O gráfico raster dos picos gerados em 20 tentativas mostra que o neurônio pode ser extremamente confiável e preciso em resposta à mesma entrada. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar experimentos dinâmicos com lâmpadas usando a caixa de ferramentas de software disponível gratuitamente. LCG. Este procedimento pode ser estendido a outros protocolos de circuito fechado para investigar uma ampla variedade de assuntos, desde excitabilidade neural até interações complexas de rede.