Simples Multiwell Rigidez Ensaio para o Estudo das respostas das células Rigidez dependentes base de poliacrilamida

O objetivo geral deste procedimento é permitir uma preparação rápida, eficiente e barata de géis de poliacrilamida em um formato de placa de vários poços. Isso é feito primeiro imprensando, a solução precursora de gel entre uma placa de vidro revestida hidrofóbica e um suporte de plástico flexível adesivo de acrilamida. O segundo passo é retirar o gel da placa de vidro, que se prendeu covalentemente ao suporte de plástico flexível após a polimerização e deixá-lo secar.

Em seguida, o gel seco e o suporte de plástico flexível subjacente são cortados nas formas desejadas e colados com o lado do plástico no fundo do poço de uma placa de vários poços ou qualquer outro recipiente de cultura de células. A etapa final é revestir os géis de poliacrilamida montados em placas de vários poços com um revestimento adesivo celular, como uma monocamada de colágeno tipo um. Em última análise, a microscopia, bem como outras técnicas de caracterização celular, são usadas para observar o efeito do substrato de poliacrilamida subjacente.

Em particular, sua rigidez no comportamento celular. A principal vantagem deste método em relação aos métodos existentes é que permite o manuseio de qualquer rigidez e espessura dos poligéis, bem como sua montagem em um formato de placa multipoço, de forma eficiente em termos de baixo custo e tempo, não proporcionada por outros métodos. A demonstração do procedimento será feita como estudante em meu laboratório.

Primeiro, prepare a solução precursora de gel de poliacrilamida misturando acrilamida, o reticulador bis acrilamida e a água deionizada dissolve Sul OPA em dimetil sulfox a 50 miligramas por mililitro. Alíquota de 20 microlitros da solução de estoque em 10 tubos de microcentrífuga. Em seguida, congele as soluções em nitrogênio líquido e armazene a 80 graus Celsius negativos.

Em seguida, dissolva o amônio por sulfato em água deionizada para obter uma concentração final de amônio por sulfato de 10% em peso por volume. Eloqua 25 microlitros da solução de amônio por sulfato em 10 tubos de microcentrífuga e armazene-o a 20 graus Celsius negativos. Prepare 0,2 miligramas por mililitro de solução de colágeno diluindo a solução estoque de colágeno tipo um em um XPBS a pH 7,4.

Todas as soluções são mantidas no gelo até o uso. Neste ponto, coloque algumas gotas de uma solução hidrofóbica em uma placa de vidro e use papel de seda para espalhar pela superfície. Depois de deixar a placa secar ao ar, limpe com papel de seda novamente para uniformizar o revestimento hidrofóbico.

Corte um suporte de plástico flexível para combinar com o tamanho da placa de vidro revestida hidrofóbica. Em seguida, marque o lado hidrofóbico do suporte de plástico flexível arranhando levemente a superfície com uma ferramenta afiada, como um bisturi. Para a preparação do gel, adicione 4972,5 microlitros de solução precursora de poliacrilamida da concentração final desejada em um tubo cônico de 50 mililitros.

Coloque o tubo em uma câmara de desgaseificação por 30 minutos com a tampa aberta. Em seguida, adicione 25 microlitros da solução de amônio por sulfato previamente preparada à solução de gel DGAs para obter uma concentração final de amônio por sulfato de 0,05% Em seguida, adicione 2,5 microlitros de TM me para obter uma concentração final de TM ME de 0,5% Misture a solução suavemente pipetando para cima e para baixo três a cinco vezes. Em seguida, coloque espaçadores de silicone da espessura desejada no lado hidrofílico do suporte de plástico flexível.

Em seguida, pipete a solução de gel no suporte de plástico flexível entre os espaçadores e o sanduíche com uma luz deslizante de vidro revestida hidrofóbica. Depois de deixar o gel polimerizar por 45 minutos, retire o suporte de plástico flexível com o gel de poliacrilamida covalentemente anexado por cima e coloque o lado do gel para secar ao ar. Depois de seco, corte o gel de poliacrilamida nas formas desejadas.

Prepare aproximadamente 500 microlitros de polimetil soano por placa de 96 poços de acordo com as instruções do fabricante para colar os géis no fundo de uma placa de vários poços. Coloque uma pequena gota de polimetil soano no centro de cada poço usando uma pinça. Coloque um gel de poliacrilamida em cada suporte de plástico flexível para baixo.

Após a cura do polidimetilsuboxano, coloque uma pequena quantidade da sampa de celulose previamente preparada em cada poço com uma pipeta de transferência e gire de um lado para o outro para revestir a superfície do gel uniformemente. Coloque a placa do poço sob uma lâmpada UV de alta intensidade por cinco minutos. Quando terminar, enxágue os géis com PBS para remover o excesso de violoncelo.

Após esta pipeta, aproximadamente 50 microlitros da solução de colágeno Tipo um previamente preparada em cada um. Bem, deixe o prato coberto em temperatura ambiente por pelo menos duas horas após o enxágue com PBS para remover o excesso de solução de colágeno. Esterilize os géis sob luz ultravioleta em uma capa de cultura de tecidos por duas horas.

Por fim, mergulhe os géis em meio completo durante a noite para hidratar e equilibrar. Use géis para assentamento de células imediatamente ou guarde na geladeira por até dois dias de módulo de idade jovem em função de várias acrilamidas e bis. As concentrações de acrilamida designadas como A e B, respectivamente, são mostradas aqui conforme previsto.

Tanto o módulo de armazenamento G linha quanto o módulo de perda G linha dupla são independentes da frequência. Também foi confirmado que a secagem e a reidratação dos géis não afetaram o módulo de seus filhotes. Ao usar o Crosslinker Sulo sampa, pode-se obter um revestimento uniforme de colágeno em hidrogéis de qualquer rigidez.

Observou-se que, quando semeadas em géis de poliacrilamida por 24 horas, as células do câncer de mama M-D-A-M-B 2 31 permaneceram redondas nos géis macios de 0,5 e um quilo pascal, mas foram capazes de se espalhar e alongar no gel rígido de 100 quilos pascal. Além disso, os hidrogéis feitos em cima do suporte de plástico flexível são transparentes e permitem fácil visualização e microscopia. Além disso, o suporte de plástico flexível não fluoresce automaticamente e, portanto, não interfere na imagem de células marcadas com fluorescência.

A morfologia celular foi quantificada em termos de área geral de espalhamento celular e circularidade celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como montar géis de poliamida de forma eficiente e barata em um formato de placa de vários poços. Para o estudo da biologia celular dependente da rigidez.