Estudando os efeitos da rigidez Matrix em função celular usando acrilamida baseado Hidrogéis
10 de agosto de 2010
O efeito da rigidez substratos em função celular podem ser modelados In vitro Usando hidrogéis de poliacrilamida de diferentes conformidades.
Para modelar a complacência tecidual in vivo utilizando hidrogéis de acrilamida. Isso é realizado primeiramente gerando lamínulas reativas na parte inferior e lamínulas superiores silanizadas. O segundo passo do procedimento é despejar e criar os hidrogéis de acrilamida.
O terceiro passo do procedimento é a reticulação da proteína da matriz extracelular de escolha ao hidrogel. O passo final do procedimento é a incubação e análise das células. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram como a compliance variável da matriz extracelular in vitro regula o comportamento celular por meio de análises utilizando microscopia de imunofluorescência, PCR quantitativo em tempo real e western blotting.
Hoje vamos mostrar o procedimento para a geração e uso de hidrogéis de acrilamida. Utilizamos este procedimento em nosso laboratório para estudar como a rigidez da matriz extracelular regula a morfologia celular, sinalização celular e proliferação. Então, vamos começar.
Inicie este procedimento gerando lamínulas reativas. Primeiro, coloque uma camada de parafilme na metade inferior de uma placa de Petri de 150 milímetros. Em seguida, transfira até nove lamínulas esterilizadas de 25 milímetros para o filme de parafina e cubra-as com um mililitro de hidróxido de sódio 0,1 molar.
Incube as lamínulas por três minutos. Após a incubação, aspire o hidróxido de sódio com uma linha de vácuo trabalhando em uma capela química e pipete 0,5 mililitros de três amino perfil trimetil ou três A-P-T-M-S sobre cada lamínula. Incube as lamínulas por três minutos e, em seguida, aspire o três A-P-T-M-S. Tenha cuidado para não incubar por muito tempo, a fim de evitar a formação de espuma na lamínula.
Lâminas após o tratamento. Enxágue as lamínulas uma vez com 20 mililitros de água desionizada no mesmo recipiente. Remova as lamínulas do recipiente usando pinças curvas e transfira-as com o lado tratado voltado para cima para um novo recipiente de 150 milímetros.
Em seguida, lave as lamínulas com água desionizada novamente e coloque-as sobre o agitador durante 10 minutos. Após a incubação, remova a água e lave mais duas vezes. É muito importante remover todo o A-P-T-M-S para que ele não reaja com o glutaraldeído e deixe um precipitado branco turvo 10 minutos antes do uso do glutaraldeído.
Usando pinças curvas, transfira as lamínulas para um recipiente limpo forrado com parafina e aspire qualquer líquido remanescente usando uma linha de vácuo. Em seguida, cubra completamente cada lamínula com 0,5 mililitros de glutaraldeído 0,5% em água desionizada estéril para promover a reticulação entre os três A-P-T-M-S e o gel de poliacrilamida. Incube as lamínulas por 30 minutos em uma capela química. Depois, aspire a solução de glutaraldeído e lave novamente as lamínulas com água desionizada.
Em seguida, seque completamente as lamínulas. Adicione novas lamínulas a um tubo Falcon de 50 mililitros contendo uma solução de vedação de superfície a 10% em clorofórmio e agite suavemente por pelo menos 10 minutos. Drene a solução de vedação de superfície e seque ao ar.
Coloque as lamínulas sobre toalhas Kim em um gabinete de segurança biológica onde os hidrogéis serão preparados, para iniciar a preparação dos hidrogéis. Utilize pinças curvas para transferir as lamínulas com o lado reativo voltado para cima para uma folha de paraforma que tenha sido fixada com fita adesiva à superfície do gabinete de segurança biológica. Certifique-se de que as lamínulas estejam completamente planas sobre a superfície da paraforma.
Em seguida, prepare uma solução saturada de CIN hidroxilado ou NHS em tolueno dissolvendo uma pequena quantidade de NHS em tolueno suficiente. Para os experimentos específicos, adicione pequenas quantidades de NHS até que o NHS não se dissolva mais. A solução saturada geralmente é turva e rosa.
Em seguida, prepare a acrilamida, BIS-acrilamida, água e um PS para atingir a porcentagem desejada de acrilamida. Adicione os reagentes aos tubos de uso micro conforme descrito no protocolo escrito. Depois, um alíquota de cada vez.
Adicione a ME NHS e TM. Vortexe o tubo brevemente e imediatamente distribua entre três e cinco géis usando 140 microlitros por lamínula nas cabines de segurança biológica. Coloque rapidamente a lamínula SILICONIZADA de 25 milímetros sobre cada gel antes que ele comece a polimerizar.
A adição da lamínula superior permitirá que a acrilamida cubra completamente a lamínula inferior. Incube este sanduíche à temperatura ambiente até que a acrilamida polimerize, para determinar quando ocorreu a polimerização. Verifique a solução residual de acrilamida no tubo de microcentrifugação.
A polimerização levará alguns minutos para géis rígidos e um pouco mais para géis macios. Após a polimerização, levante cuidadosamente o sanduíche usando luvas estéreis. Em seguida, deslize a lamínula superior até que ela fique projetada além do gel polimerizado.
Em seguida, levante a tampa. Retire o gel e descarte a lamínula superior. Coloque cada lamínula inferior do gel, doravante denominada hidrogel, em uma placa de seis poços.
Em seguida, adicione dois mililitros de solução salina tamponada com fosfato ou PBS por poço de uma placa de seis poços. Depois, lave os hidrogéis com PBS e incube em um agitador durante cinco minutos. Repita essa lavagem duas vezes.
Para iniciar o experimento, cubra cada hidrogel com dois mililitros de uma solução de fibronectina ou outra proteína da matriz extracelular. Incube a proteína no hidrogel durante a noite a quatro graus Celsius para permitir sua ligação covalente ao hidrogel; após a incubação prolongada, aspire a solução de matriz extracelular. Em seguida, bloqueie os grupos NHS não reativos com um miligrama por mililitro de albúmina sérica bovina livre de ácidos graxos ativada pelo calor, em meio livre de soro, e incube por pelo menos 30 minutos a 37 graus Celsius.
Após a incubação, lave os hidrogéis uma vez com PBS estéril. Em seguida, plaque as células no meio de cultura apropriado contendo soro bovino fetal sobre o hidrogel aqui.
Utilizam-se fibroblastos embrionários de camundongo estabelecidos. Determine o número de células a ser semado no hidrogel com base no grau de espalhamento celular e confluência necessários para o experimento. Aproximadamente 10 elevado a cinco células são necessárias para análise por western blot e PCR quantitativo.
Em seguida, incubar as células em condições apropriadas para o tipo celular específico. Após o período de incubação, extrair a proteína celular ou o mRNA conforme necessário.
Pipete gotas de 100 microlitros de tampão de lise sobre uma folha de paraforma na bancada do laboratório, deixando aproximadamente dois a três centímetros entre cada gota. Em seguida, remova cuidadosamente cada hidrogel levantando a lamínula inferior do poço. Usando pinças curvas, posicione o lado celular para baixo sobre as gotas.
Incube as células com o tampão de lise por exatamente um minuto. Por fim, remova as lamínulas e transfira o tampão de lise para um tubo de microcentrífuga. Alternativamente, ao extrair RNA, transfira cada hidrogel para uma nova placa de seis poços e adicione um mililitro de triazol por poço.
Incube os géis por três minutos após a incubação. Remova a solução de triazol para armazenamento em um tubo de microcentrífuga. A lavagem completa das lamínulas após a adição de A-P-T-M-S é uma etapa importante para a produção de lamínulas reativas.
Lâminas de vidro adequadamente lavadas e secas estão livres de resíduos precipitados. A-P-T-M-S reagirá com o glutaraldeído e produzirá um precipitado branco turvo. Se houver precipitado, todo o procedimento deve ser repetido, pois a lâmina de vidro não é mais utilizável.
Após a formação do hidrogel e o revestimento com proteínas da matriz extracelular, as células são semeadas durante a noite. Existe uma diferença distinta na espalhamento celular em hidrogéis rígidos em comparação com hidrogéis macios, como pode ser observado pelo dobramento na coloração, sendo que os fibroblastos embrionários de camundongo se espalham mais extensamente em hidrogéis rígidos do que em hidrogéis macios. De fato, a maioria das células que se ligam a um hidrogel macio permanecerá compacta e se aderirá com menor eficiência.
Resultados representativos de PCR quantitativa dos níveis de mRNA de ciclina D1 em fibroblastos embrionários de camundongo mostram que a ciclina D1 é significativamente superexpressa em uma matriz rígida, mas não em uma matriz macia. Isso sugere que a rigidez da matriz regula a progressão do ciclo celular in vitro. Acabamos de mostrar como gerar hidrogéis com diferentes rigidezes, modelando as condições fisiológicas in vivo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de preparar lamínulas reativas extras, pois acidentes e erros podem ocorrer.
Assim sendo, é isso. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este estudo investiga o impacto da rigidez dos substratos na função celular utilizando hidrogéis de poliacrilamida. A metodologia inclui a criação de hidrogéis com diferentes níveis de compliance para modelar as condições teciduais in vivo.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia celular
- Biomateriais
- Engenharia de tecidos
Contexto
- O comportamento celular é influenciado pelas propriedades mecânicas da matriz extracelular.
- Os hidrogéis de poliacrilamida podem imitar a rigidez dos tecidos biológicos.
- Compreender essas interações é essencial para aplicações em engenharia de tecidos.
- A microscopia de imunofluorescência e as técnicas de PCR são utilizadas para análise.
Objetivo do Estudo
- Modelar in vitro a complacência tecidual in vivo.
- Avaliar como a variação da complacência da matriz extracelular afeta o comportamento celular.
- Fornecer informações sobre as respostas celulares a estímulos mecânicos.
Métodos Utilizados
- Preparação de lamínulas reativas inferiores e lamínulas superiores silanizadas.
- Criação de hidrogéis de acrilamida com diferentes níveis de rigidez.
- Reticulação de proteínas da matriz extracelular aos hidrogéis.
- Incubação e análise de células utilizando microscopia de imunofluorescência, PCR quantitativo em tempo real e eletroforese em gel de proteínas (western blotting).
Resultados Principais
- Os resultados demonstram como a complacência da matriz extracelular regula o comportamento celular.
- A microscopia de imunofluorescência revela alterações na morfologia celular.
- A PCR quantitativa em tempo real mostra variações na expressão gênica associadas à rigidez.
- O Western blot confirma alterações na expressão proteica em resposta à complacência do substrato.
Conclusões
- A rigidez do substrato influencia significativamente as funções celulares.
- Os hidrogéis de poliacrilamida são eficazes para modelar a complacência tecidual.
- Os achados têm implicações para engenharia de tecidos e medicina regenerativa.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A modelagem da rigidez tecidual in vitro permite a desmistificação mecanicista de alvos terapêuticos ao associar a compliance da matriz extracelular a fenótipos celulares. Essa abordagem apoia a validação de alvos em fibrose, oncologia e doenças cardiovasculares, fornecendo sistemas relevantes à doença que predizem as respostas celulares a estímulos biomecânicos. A integração de plataformas baseadas em hidrogéis no início da descoberta melhora a confiança preditiva e orienta a triagem de portfólios com base na relevância fisiopatológica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investigar hipóteses terapêuticas ao avaliar como a rigidez da matriz regula as vias de sinalização celular envolvidas na proliferação e fibrose.
- Valor Operacional: Permitir a validação funcional de alvos utilizando condições de rigidez relevantes para a doença que imitam microambientes in vivo.
- Valor Preditivo: Apoiar a tomada de decisões pré-clínicas ao identificar alvos cuja atividade é modulada pela complacência da matriz extracelular.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Prepare hidrogéis padronizados revestidos com proteínas da matriz extracelular para criar substratos reprodutíveis para triagem de compostos.
- Resultados Quantitativos: Gerar parâmetros mensuráveis, como expressão gênica (por qPCR) e níveis proteicos (por Western blot), que se correlacionam com fenótipos dependentes da rigidez.
- Escalabilidade da Triagem: Permitir a avaliação de agentes farmacológicos em uma faixa de complacências que mimetizam tecidos, a fim de identificar eficácia específica ao contexto.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modele condições de fibrose, estroma tumoral e rigidez vascular ajustando a elasticidade do hidrogel a faixas fisiopatológicas.
- Continuidade Tradutiva: Una fluxos de trabalho de descoberta e pré-clínicos utilizando sistemas definidos por rigidez consistentes nas etapas de validação de alvos e otimização de compostos líderes.
- Avanço Ajustado ao Risco: Subsidie decisões de prosseguir ou interromper com base na manutenção dos efeitos do composto sob estímulos mecânicos fisiologicamente relevantes.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a validação pré-clínica, particularmente para vias mecanossensíveis na fibrose e no câncer.
- Biologia da Descoberta: Apoia a elucidação de vias ao associar a rigidez da matriz a alterações na expressão da ciclina D1 e na progressão do ciclo celular.
- Triagem: Permite a padronização de ensaios por meio da rigidez ajustável dos hidrogéis e do revestimento consistente com proteínas da matriz extracelular, garantindo avaliação confiável da resposta a compostos.
- Análises: Oferece leituras quantitativas por imunofluorescência, qPCR e Western blotting para comparar as respostas celulares em diferentes condições de rigidez.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais a modelos pré-clínicos utilizando faixas de rigidez que refletem tecidos doentes, como fígado fibrotico ou tumores.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma ajustável e reutilizável para avaliar alvos em diversas áreas de doenças nas quais a remodelação da matriz extracelular é uma característica marcante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar a rigidez da matriz como uma variável que influencia o comportamento celular e o engajamento de alvos.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de fabricação de hidrogéis e reticulação de proteínas.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao reduzir riscos de alvos precocemente com base em sua resposta ao contexto biomecânico.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de compostos que mantêm atividade em diferentes faixas de rigidez fisiológicas e patológicas.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência na preparação de biomateriais e química de superfície para a geração de lamínulas reativas.
- Depende do acesso à reometria ou ao MFA para validação da rigidez e consistência entre lotes.
- Necessita padronização das etapas de revestimento com proteínas da MEC e bloqueio para garantir apresentação uniforme de ligantes.
- Envolve considerações de adaptação ao transferir o sistema para diferentes tipos celulares ou formatos de cultivo tridimensional.
- Inclui limitações práticas, como descolamento do hidrogel caso as etapas de lavagem sejam insuficientes ou se a reticulação com glutaraldeído for incompleta.
