Separação de Single-stranded DNA, Double-stranded DNA e RNA de uma Comunidade Ambiental Viral Usando Cromatografia hidroxiapatita

Este vídeo demonstra um procedimento para separar associações virais mistas com base na composição de seus ácidos nucleicos. Isso permite o estudo da diversidade taxonômica e do potencial funcional de associações virais complexas. Aqui, a hidroxiapatita, uma forma cristalina de fosfato de cálcio, é empregada na separação de ácidos nucleicos.

Primeiro, uma coluna de hidroxiapatita é empacotada e equilibrada; em seguida, os ácidos nucleicos virais purificados são aplicados na coluna. A interação eletrostática entre os íons de cálcio positivamente carregados da hidroxiapatita e a estrutura fosfato negativamente carregada dos subtipos de ácidos nucleicos liga os ácidos nucleicos à coluna Nick. A seguir, o DNA-RNA de fita simples e o DNA de dupla fita são eluídos sequencialmente com diferentes concentrações de tampão fosfato. Os ácidos nucleicos resultantes são então dessalinizados e concentrados para preparação à visualização, quantificação e identificação por sequenciamento de DNA. A eletroforese em gel de agarose confirma que as espécies de ácidos nucleicos podem ser separadas com menos de 9% de arraste.

Assim, este método permite a avaliação da diversidade e da capacidade funcional de comunidades virais. Olá, meu nome é Doug Fro e sou pesquisador associado no laboratório da Dra. Shannon Williamson no Instituto j Craig Venture. Hoje, vou mostrar a você um procedimento para separar DNA de fita simples, DNA de dupla fita e RNA de um conjunto viral ambiental.

Este método apresenta vantagens em comparação com métodos existentes, como o tratamento com o núcleo, que tem como alvo o DNA ou o RNA. A cromatografia em hidroxiapatita tem a capacidade de capturar toda a comunidade viral. Este método permite-nos responder a diversas questões no campo da ecologia viral.

Por exemplo, qual é o complemento gênico total ou a diversidade da comunidade viral? Primeiramente, pensamos neste método quando desejamos estudar inteiramente os assembléias de plâncton do Rio provenientes da Baía de Chesapeake, sem descartar um subconjunto da assinatura genética. As soluções necessárias para este experimento devem ser preparadas com antecedência, conforme as instruções do protocolo escrito anexo, e incluem tampão fosfato 0,12 molar, tampão fosfato 0,20 molar, tampão fosfato 0,40 molar e solução fosfato um molar.

Tudo em pH 6,8 e hidroxiapatita hidratada no dia do experimento; equilibre todos os tampões fosfato e a hidroxiapatita hidratada colocando-os em banho-maria a 60 graus Celsius. Inicie este procedimento preparando a coluna econo que será utilizada para a separação dos ácidos nucleicos virais. Prenda uma torneira na extremidade da coluna econo e certifique-se de que ela está fechada.

Usando uma pipeta, adicione água desionizada à coluna, em seguida coloque a tampa na parte superior da coluna e inverta-a repetidamente para enxaguá-la. Descarte a água e repita essa lavagem várias vezes. Em seguida, remova a torneira da coluna Econ e autoclave-a para esterilizá-la.

A torneira de fechamento não é autesterilizável, pois irá derreter. Enxágue a torneira de fechamento com água ionizada, depois novamente com etanol 70% e deixe secar ao ar após a autoclavação. Substitua a torneira de fechamento e feche-a.

Em seguida, trabalhando em uma capela, adicione um mililitro de revestimento sigma à coluna e cubra a superfície de vidro da coluna invertendo-a com um movimento de rolagem, conforme mostrado aqui. O revestimento com sigma coat minimizará a adesão dos ácidos nucleicos à superfície de vidro. Durante a separação, as superfícies de vidro salino já foram revestidas.

Abra a torneira e transfira para um tubo cônico. Em seguida, para ligar a coluna a um banho de água circulante, utilize dois grampos para fixar a coluna a um suporte com haste. Conecte uma mangueira de silicone ao banho de água circulante, de modo que o fluxo de água proveniente do banho ocorra de baixo para cima.

Defina a temperatura em 60 graus Celsius e inicie a circulação. Embora na prática a coluna e as tubulações sejam envolvidas por um agente isolante, como papel alumínio ou isolamento térmico para tubos, para minimizar a perda de calor, este passo não é mostrado aqui.

Para visualizar melhor o procedimento, feche a torneira de passagem. Usando uma pipeta, adicione 10 mililitros de água estéril livre de RNAses. Abra a torneira de passagem e permita que a água escoe.

Em seguida, lave novamente seguindo a segunda lavagem. Enxágue duas vezes com 10 mililitros de tampão fosfato estéril livre de RNAses de 0,12 molar e decante entre as lavagens. A coluna está agora pronta para a cromatografia em hidroxipatita.

Certifique-se de que a torneira da coluna econ esteja fechada. Em seguida, utilizando uma pipeta serológica estéril de dois mililitros, adicione lentamente dois mililitros do hidroxiapatita reidratada e re-suspensa preparada na parte inferior da coluna. Substitua a tampa da coluna.

Deixe o hidróxi apetite sedimentar sob a força da gravidade por 30 minutos. Este método exige atenção aos detalhes. A coluna de hidróxi apetite processa a uma taxa de 0,25 a 0,5 mils por minuto.

Portanto, é muito importante observar atentamente a coluna para que ela não seque. Após 30 minutos, abra a torneira para drenar o tampão em um recipiente de resíduos. Feche a torneira e descarte o fluxo inicial.

Combine os ácidos nucleicos com tampão fosfato 0,12 molar em um volume final de 500 microlitros e incube a 60 graus Celsius por 10 minutos. Isso equalizará a temperatura dos ácidos nucleicos com a da coluna e melhorará a separação das diferentes espécies de ácidos nucleicos, removendo eventuais estruturas secundárias que possam estar presentes. Utilizando uma pipeta serológica de dois mililitros, aplique rapidamente a solução de ácidos nucleicos na hidroxiapatita, tomando cuidado para não perturbar a coluna.

Uma vez que os 500 microlitros inteiros tenham passado pela coluna, uma pequena quantidade de tampão fosfato 0,12 molar pode ser adicionada ao topo da coluna para evitar que ela seque. Deixe os ácidos nucleicos se ligarem à hidroxiapatita por 30 minutos. Após a incubação de ligação, coloque um tubo cônico de 15 mililitros sob a coluna.

Em seguida, abra a torneira e colete a amostra inicial de 500 microlitros, que contém DNA de fita simples. Após coletar 500 microlitros, feche a torneira. Em seguida, adicione seis mililitros de tampão fosfato 0,12 molar ao hidroxiapatita, tomando cuidado para não perturbar a coluna.

Em seguida, abra a torneira de passagem e continue a coletar o fluxo que atravessa, contendo DNA de fita simples, no mesmo tubo de 15 mililitros do passo anterior. Após a coleta de aproximadamente seis mililitros, feche a torneira de passagem. Adicione um volume de uma solução de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico ao tubo e misture vigorosamente em vórtex, depois centrifugue a 3.500 × g por 15 minutos.

Após a centrifugação, o tubo conterá duas camadas. Transfira a camada superior aquosa, que contém a fita simples de DNA, para um novo tubo de 15 mililitros e armazene a amostra à temperatura ambiente para eluir e purificar o RNA da coluna, adicione seis mililitros de tampão fosfato 0,20 molar e colete os fluxos antes de usar um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, realize uma extração com fenol-clorofórmio.

No caso da amostra de DNA de fita simples, repita este processo utilizando seis mililitros de tampão fosfato 0,40 molar para eluir e purificar o DNA de dupla fita da coluna. Por fim, para remover qualquer resíduo de DNA de dupla fita da coluna, repita este processo mais uma vez.

Este momento usando seis mililitros de tampão fosfato 1,00 molar para dessalinizar as amostras de ácidos nucleicos. Transfira quatro a cinco mililitros de cada amostra para um dispositivo de filtração centrífuga Ultra quatro equipado com uma membrana de célula ultra com corte de peso molecular de 30.000 para concentrar a amostra em menos de 500 microlitros, centrifugando a 6.000 ×g a 30 graus Celsius por cerca de cinco minutos em um rotor de ângulo fixo. Após descartar o fluxo passante, adicione o restante das amostras ao filtro.

Aumente o volume até quatro a cinco mililitros com tampão XTE 1X livre de RNAses. Em seguida, gire novamente até obter um volume concentrado. Aproximadamente cinco minutos após a centrifugação, adicione quatro a cinco mililitros de tampão XTE 1X livre de RNAses ao filtro e concentre.

Novamente, repita esta lavagem por mais cinco vezes para dessalar completamente as amostras de ácidos nucleicos. Uma vez que as amostras tenham sido totalmente concentradas e dessaladas, transfira as amostras restantes de ácidos nucleicos para um tubo estéril de microcentrifugação de 1,7 mililitro. Precipite os ácidos nucleicos adicionando um décimo do volume de acetato de sódio, dois volumes de etanol a 100% e um microlitro de glicoblue, misturando bem por vortexagem e centrifugação.

28.000 × g a quatro graus Celsius durante 60 minutos em Kent. Certificando-se de não perturbar o pellet.

Adicione 300 microlitros de etanol a 70%, centrifugue a 28.000 ×g em temperatura ambiente por 10 minutos, não deixe secar e reconstitua cada fração em um volume apropriado de tampão TE livre de RNAses. Concentrações iguais dos ácidos nucleicos virais M13 MP18, DNA de fita simples, MS2, RNA de fita simples, FI6, RNA de fita dupla e Lambda, DNA de fita dupla foram combinadas e, em seguida, separadas por cromatografia em hidroxipatita, conforme mostrado neste vídeo. Concentrações iguais de M13 MP18, DNA de fita simples, MS2, RNA de fita simples, FI6, RNA de fita dupla e Lambda, DNA de fita dupla foram combinadas, conforme mostrado na faixa seis, e aplicadas a uma coluna de hidroxipatita, como pode ser visto aqui.

DNA-RNA de fita simples e DNA de dupla fita foram independentemente eluídos da coluna de hidroxiapatita utilizando tampão fosfato 0,12 molar, 0,18 molar, 0,40 molar e 1,00 molar. Uma escada de 1 kb foi utilizada para confirmar os tamanhos genômicos. Esses resultados indicam que este método pode ser usado para separar com sucesso DNA de fita simples, DNA de dupla fita e RNA com menos de 9% de contaminação residual de uma fração para a próxima.

Este método também foi utilizado para separar ácidos nucleicos isolados de uma comunidade viral dentro da Baía de Chesapeake, conforme mostrado aqui. O DNA-RNA de fita simples e o DNA de fita dupla foram eluídos independentemente usando concentrações de tampão fosfato de 0,12 molar, 0,20 molar e 0,40 molar, ou 1,00 molar, respectivamente. Uma escada de DNA de alta massa na via um e uma escada de 1 KB na via dois foram utilizadas para confirmar visualmente o peso molecular e a massa aproximados dos ácidos nucleicos, como pode ser observado aqui. O DNA de fita dupla foi o tipo predominante de ácido nucleico extraído do plâncton viral da Baía de Chesapeake. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como separar ácidos nucleicos de uma associação viral mista utilizando cromatografia de hidroxipatita.

Isso inclui a preparação da coluna de hidroxiapatita e dos ácidos nucleicos, a separação e eluição dos ácidos nucleicos utilizando várias concentrações de tampão fosfato e a dessalinização, além da concentração dos ácidos nucleicos após a separação.