Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

O objetivo geral deste procedimento é direcionar a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em células epiteliais maduras das vias aéreas, usando uma cultura 3D configurada com andaimes pulmonares descelularizados. Este método pode ajudar a responder a questões-chave na área do desenvolvimento pulmonar, como o papel das contrações da matriz celular e da sinalização do fator de crescimento durante a diferenciação da linhagem pulmonar. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa um sistema de cultura 3D em um ambiente livre de soro definido e alcança uma diferenciação epitelial robusta das vias aéreas com contaminação limitada de outras linhagens de endoderme. Após a eutanásia de um rato wistar adulto, de acordo com o protocolo de texto, prenda o animal a uma superfície de dissecação fixando as patas dianteiras e traseiras e use etanol a 70% para pulverizar no peito e no abdômen. Crie uma incisão logo abaixo da caixa torácica. Corte a pele e exponha o diafragma. Em seguida, faça pequenas incisões no diafragma, para fazer com que os pulmões se retraiam, reduzindo a chance de puncionar os pulmões. Em seguida, crie uma incisão vertical ao longo do esterno e abra a cavidade torácica para acessar o coração e os pulmões. Em seguida, com uma sutura, ligue a veia cava inferior e use uma pequena tesoura de dissecação para colocar uma pequena incisão no átrio esquerdo. Usando uma seringa preparada de 10 ml com uma agulha de calibre 25 cheia de solução salina heparinizada de Hank's Balance, inicie a perfusão pulmonar inserindo a agulha no ventrículo direito e empurre o tampão através da circulação pulmonar. Continue a perfusão até que os pulmões fiquem brancos e o fluido que flui do átrio esquerdo fique claro. Após a perfusão, exponha a traqueia e faça uma pequena incisão perto da cartilagem tireóide para canulação. Em seguida, com um cateter de plástico, canule a traqueia e use uma sutura para prendê-la no lugar. Agora, configure um sistema de perfusão por gravidade fixando uma seringa de 10 ml a um suporte de retorta e clamp. Em seguida, remova e descarte o êmbolo da seringa. Fixe o ponto de enchimento máximo no corpo da seringa a 20 cm acima dos pulmões e, em seguida, prenda uma torneira bidirecional na extremidade da seringa e um tubo de plástico comprido na outra extremidade da torneira. Retire suavemente o cateter da traqueia e prenda-o na extremidade do tubo de plástico. Em seguida, despeje a solução de descelularização na seringa e deixe a solução preencher completamente o tubo de plástico e o cateter conectados. Coloque o cateter cheio de solução de volta na traqueia e lave os pulmões enchendo até a capacidade pulmonar total por um minuto. Em seguida, remova o cateter da traqueia para permitir que o fluido flua para fora dos pulmões. Repita a lavagem dos pulmões oito vezes com solução de descelularização, seguida de dez enxágues com PBS. Os pulmões ficarão brancos com a conclusão das etapas de lavagem. Em seguida, disseque a traqueia e os pulmões do pescoço e da cavidade torácica. Remova o excesso de tecido dos pulmões dissecados, incluindo o esôfago e o coração, e transfira os pulmões para PBS frio até a preparação para a secção do vibrato. Para preparar seções grossas, faça aproximadamente 15ml de agarose de baixo ponto de fusão de 2% e 4% em PBS e 6% de agarose suficiente para incorporar todos os lóbulos em pequenos blocos retangulares. Depois de transferir a agarose para tubos de 15ml, coloque os tubos em um bloco de calor e mantenha a temperatura acima de 40 graus Celsius para evitar gelificação. Usando uma tesoura pequena, disseque o pulmão descelularizado no final de cada brônquio lobar e descole cada lobo. Em seguida, use lençóis absorventes para remover o excesso de PBS e transfira os lóbulos para 2% de agarose no bloco de aquecimento por cinco minutos para revestir o tecido. Depois de transferir cada lóbulo para uma placa de Petri, coloque a placa em uma placa fria e deixe a superfície gelificar por um minuto. Coloque delicadamente os lóbulos em 4% de agarose e, após incubar por cinco minutos e esfriar, repita o revestimento com 6% de agarose. Após o revestimento, use moldes de base de metal para incorporar cada lóbulo separadamente em 6% de agarose, com pelo menos 3 ml de agarose ao redor do tecido pelas bordas. Em seguida, com uma pinça, oriente cada lóbulo posicionando a maior borda plana do tecido na superfície do molde de metal voltado para o experimentador e conclua a incorporação usando de plástico. Deixe os blocos gelificarem em uma placa fria por pelo menos 30 minutos antes do seccionamento do vibratomo. Como alternativa, armazene os blocos em uma câmara umidificada por até 12 horas a quatro graus Celsius antes do seccionamento do vibratomo. Para preparar seções, configure o vibratomo enchendo a câmara de seccionamento com PBS frio. Configure um banho de gelo ao redor para manter uma temperatura fria durante todo o corte. Agora, remova os blocos dos moldes de metal e use uma lâmina de barbear para aparar o excesso de agarose ao redor dos lóbulos, mantendo aproximadamente três milímetros da borda do tecido. Usando adesivo, fixe o tecido no centro da placa da amostra e mergulhe a placa na câmara de corte preenchida com PBS. Carregue a lâmina de corte no vibratome. Defina os limites de corte no vibratome, selecionando os seguintes valores de velocidade, amplitude e espessura, respectivamente. Separe cada lóbulo completamente e, se as seções não se separarem totalmente umas das outras, use uma tesoura pequena para cortar manualmente as seções. Em seguida, colete suavemente as seções do andaime e transfira para PBS frio. Usando uma pinça, libere suavemente cada seção da agarose circundante. Para descontaminar as seções do andaime, depois de transferi-las do PBS para os tubos de microcentrífuga, adicione 90 unidades por mililitro de nuclease no PBS e incube em um rotador em temperatura ambiente por 12 a 24 horas. Após a transferência das seções para novos tubos de microcentrífuga, de acordo com o protocolo de texto, em condições estéreis, adicione solução antimicrobiana e incube em um rotador em temperatura ambiente por seis horas. Em seguida, em condições estéreis, use PBS para enxaguar os andaimes duas vezes e transferi-los para o meio livre de soro, ou SFDM, antes da semeadura com as células. Para configurar uma cultura de interface ar-líquido, use uma pinça estéril para colocar membranas hidrofóbicas em uma placa de Petri. Em seguida, transfira cada seção de andaime descelularizada do SFDM para uma membrana, garantindo que as seções sejam espalhadas uniformemente na membrana. Prepare placas de seis ou doze poços enchendo os poços com 1 ml ou 0,5 ml de SFDM, respectivamente. Em seguida, coloque suavemente as membranas nos poços, permitindo que a membrana flutue em cima do meio, criando uma configuração de cultura de ar líquido. Para semear andaimes 3D, após a preparação de células endodérmicas e classificação de células ativadas por fluorescência, para enriquecer para um endoderma definitivo, use um hemocitômetro para contar as células classificadas. Em seguida, gire as células a 400 Gs por cinco minutos. Usando SFDM, ressuspenda as células peletizadas para aproximadamente 100.000 células em 10