Preparação de Amostras para Análise Mass Citometria

O objetivo geral deste processo de preparação de amostras é produzir uma coloração de anticorpos robusta e consistente de diversas amostras para permitir a interrogação de populações de células heterogêneas. Este método pode ajudar a responder a perguntas sobre identidade celular, sinalização celular e resposta celular em uma população celular heterogênea complexa. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a medição de níveis de proteína de alto parâmetro no nível de célula única.

Demonstrando este procedimento estará Aundrietta Duncan, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório. Para cada amostra de suspensão de célula única, ressuspenda-a em quatro vezes 10 elevado a sexto por mililitro em meio livre de soro, adicione 500 microlitros de cisplatina 50 micromolar recém-preparada por 2/10 nas seis células e incube as amostras em um agitador orbital com mistura constante à temperatura ambiente. Após um minuto, tempere a cisplatina com um volume igual de tampão de lavagem e centrifugue as células.

Descarte o sobrenadante e lave as amostras mais duas vezes adicionando 500 microlitros de tampão de lavagem, centrifugando as células e despejando o tampão de lavagem. Em seguida, duas lavagens em 500 microlitros de PBS, centrifugando as amostras e descartando o sobrenadante. Após a segunda lavagem com PBS, ressuspenda os pellets em 500 microlitros de PBS fresco e fixe as células com 500 microlitros de 4% de PFA.

Pipete as células para misturar. Em seguida, colocar as amostras no agitador orbital com mistura constante durante 15 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, pulverizar as células por centrifugação, despejar o sobrenadante e, em seguida, lavar em PBS fresco.

Para permeabilizar as células, gire as células novamente e descarte os sobrenadantes. Ressuspenda as amostras no PBS residual por vórtice suave e adicione imediatamente um mililitro de metanol a 100% por 2/10 10 às sextas células com pipetagem suave. Incubar as amostras a quatro graus durante pelo menos uma hora e, no final da incubação, centrifugar as células.

Depois, despeje o metanol. Em seguida, lave os pellets em um mililitro de tampão de lavagem para cada mililitro de metanol, seguido por mais duas lavagens em 500 microlitros de tampão de lavagem fresco. Usando uma pipeta de 200 microlitros ajustada para 50 microlitros, transfira o tampão de lavagem restante de cada pellet para um tubo do coquetel de anticorpos correspondente apropriado.

Pipete a solução combinada sem aspirar ar para a ponta, mantendo o êmbolo parcialmente pressionado. Em seguida, transfira a ponta da pipeta para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 500 microlitros de tampão de lavagem sem soltar o êmbolo. Solte o êmbolo, levantando o tampão de lavagem para um volume total de coquetel de anticorpos de 50 microlitros e rotule a amostra correspondente apropriada com o coquetel de anticorpos aspirado por pipetagem suave.

Após uma hora em temperatura ambiente com agitação constante, lave as amostras quatro vezes, despejando o tampão de lavagem a cada vez. Para rotular as células com irídio, ressuspenda os pellets finais em 500 microlitros de PBS, seguido pela adição de 500 microlitros de quatro por cento de PFA por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione 500 microlitros de irídio 62,5 nanomolar recém-preparado e PFA às amostras por mais 15 minutos de agitação à temperatura ambiente.

Em seguida, centrifugue as células, despeje o sobrenadante e siga por duas lavagens em 500 microlitros de 0,1% de BSA e água deionizada filtrada. Analise as amostras adicionando grânulos de normalização nos poços das placas de amostra, pipetando células nesses poços e, em seguida, realizando citometria de massa em 24 horas. Após a normalização da intensidade do sinal, os grânulos de calibração podem ser removidos dos dados por gating na população negativa de grânulos positivos de irídio 191.

Os eventos de célula única podem então ser bloqueados para remover os detritos e multipletos de células usando um gráfico biaxial de expressão negativa de irídio 193 versus o comprimento do evento. A marcação com cisplatina pode ser usada para medir a quantidade de profundidade celular. Por exemplo, aqui são mostradas amostras com quantidades baixas e maiores de células mortas.

As células mortas podem ser removidas afastando a população positiva de platina 198, o código de barras resulta em uma separação distinta das amostras dentro dos parâmetros de código de barras, permitindo que as células sejam atribuídas às suas identidades de amostra originais. A marcação de UDI pode ser usada para detectar células faciais de US observadas aqui. Após a normalização inicial, de-barcoding e gating, os dados de alta dimensão podem ser analisados usando o algoritmo SPADE para gerar uma representação dimensional inferior dos dados que é mais passível de interpretação visual.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída dentro de quatro a seis horas, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de minimizar a perda de amostra ao fazer a etapa de lavagem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar amostras para análise de citometria de massa.

Não se esqueça de que trabalhar com azida sódica pode ser perigoso, portanto, você deve tomar precauções como usar EPI adequado ao realizar este procedimento.