Aplicação da estimulação crônica para estudar ratos induzida pela atividade contrátil adaptações fenotípica de músculo esquelético
25 de janeiro de 2018
Este protocolo descreve o uso do modelo de atividade contrátil crônica de exercício para observar adaptações do músculo esquelético induzida por estimulação no membro posterior de ratos.
O modelo de atividade contrátil crônica do exercício é útil para estudar as adaptações do músculo esquelético aos estímulos do treinamento físico in vivo. Em particular, este modelo provoca as adaptações fenotípicas de um protocolo de treinamento de seis semanas em sete dias. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da fisiologia muscular, como biogênese mitocondrial, autofagia e muitas outras adaptações celulares associadas ao exercício.
A principal vantagem desta técnica é que ela permite a observação de adaptações musculares específicas em um curto período de tempo de sete dias, em comparação com outros protocolos de treinamento físico que requerem vários meses. As implicações dessa técnica se estendem à terapia da atrofia muscular porque a estimulação muscular crônica demonstrou ter um efeito na melhora da fraqueza muscular relacionada ao envelhecimento. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido à dificuldade de marcar o nervo fibular comum e conectar bobinas elétricas em ambas as extremidades, pois exigem prática e precisão.
Comece anestesiando o rato sob inalação de isoflurano de um a 3% com oxigênio e confirme a sedação completa verificando a resposta a um beliscão do dedo do pé do membro posterior e observando a profundidade e a frequência respiratória. Aplique lubrificante ocular nos olhos para evitar o ressecamento e coloque o rato em uma almofada de aquecimento em uma configuração baixa a média. Raspe suavemente o membro posterior esquerdo, bem como uma tira ao redor do tronco, da parte de trás do pescoço, atrás dos membros anteriores e ao longo do tórax anterior.
Limpe suavemente as áreas depiladas com iodo e álcool etílico para desinfetar. Com o animal deitado de bruços, use um bisturi estéril com lâmina número 10 para fazer uma pequena incisão de cerca de 0,5 centímetros na nuca, no centro da região raspada. Em seguida, role o animal para o lado direito e faça um corte de dois a três centímetros na pele do membro posterior esquerdo entre a covinha da articulação do joelho e perto da origem da cauda.
Usando uma tesoura cirúrgica curva de ponta romba, disseque a área subcutânea em cerca de 3,5 a quatro centímetros, separando a pele do músculo subjacente para fazer uma bolsa entre a pele aberta e o músculo subjacente. Em seguida, use uma tesoura cirúrgica para fazer uma pequena incisão de menos de 0,5 centímetros no músculo bíceps femoral, garantindo que as pontas da tesoura estejam cortando diretamente o músculo. Em seguida, abra suavemente a área de corte até que os grupos musculares internos e o nervo fibular comum estejam visíveis.
Tenha muito cuidado para evitar cortar ou danificar o nervo. Em seguida, prepare 50 a 60 centímetros de fio de aço inoxidável fino revestido de PTFE e dobre-o ao meio. Prenda a parte dobrada do fio na fenda de uma haste de aço inoxidável de 30 centímetros.
Use a haste para passar o fio através da bolsa aberta do membro posterior, subindo pela perna e ao longo do centro das costas em um padrão em forma de L para alcançar a pequena área de incisão na parte de trás do pescoço. Fixe a janela puxando-a com afastadores de metal até que o tamanho da janela seja de aproximadamente 1,5 centímetros quadrados com o nervo fibular no centro da janela. Usando um bisturi, descasque cuidadosamente as pontas do fio em 1,5 centímetros.
Enrole as pontas do fio descascado em torno de uma agulha de calibre 21 cega cinco vezes para fazer uma bobina. Assim que as bobinas estiverem devidamente feitas, solte a agulha delas. Faça um nó na extremidade da bobina e suture-o no lado esquerdo do nervo, garantindo que a bobina esteja a 1,5 a 2,5 milímetros do nervo.
Para prender a bobina, aplique duas ou três suturas adicionais ao longo da bobina. Esta etapa requer prática e paciência consideráveis para evitar danos ao nervo e ao músculo subjacente e para alcançar todas as condições de estimulação consistentes em todos os animais. É melhor ter um pesquisador qualificado para concluir todos os procedimentos cirúrgicos durante um estudo.
Aplique duas ou três gotas de solução antibiótica e, em seguida, suture cuidadosamente a janela usando seda tamanho 5-0. Enrole frouxamente a folga restante do fio e empurre para dentro da bolsa subcutânea acima da incisão suturada do músculo bíceps femoral acima do quadril. Aplique duas a três gotas de solução antibiótica e feche a pele aberta grampeando.
Em seguida, mova o animal para a posição esternal e corte o laço de arame que sai da incisão na parte superior do pescoço para criar duas extremidades de arame. Usando um bisturi, descasque as pontas dos fios em 0,5 centímetros. Corte todos os fios desgastados.
Empurre lentamente as partes descascadas dos fios no orifício dos soquetes dos pinos e, usando um ferro de solda, solde os fios nos soquetes dos pinos. Passe as extremidades do fio conectado ao pino por uma gaze estéril de 4.4 centímetros. Em seguida, passe os fios pelo orifício na base da caixa do estimulador.
Insira os pinos nos soquetes de conexão da unidade CCA. Coloque suavemente a unidade CCA na câmara usando uma tachinha adesiva para prender a unidade CCA na parte inferior da câmara. Use fita atlética ou fita cirúrgica porosa para fixar a câmara ao redor do torso raspado.
Feche a parte superior da câmara com três camadas de fita adesiva. E termine enrolando fita adesiva nas laterais da caixa do estimulador para prender a caixa. Verifique se o CCA está funcionando expondo a unidade a um único pulso de luz infravermelha emitida por uma luz estroboscópica infravermelha portátil.
Se o CCA estiver funcionando corretamente, os músculos dos membros posteriores se contrairão em resposta à luz infravermelha. Pesar os animais pouco antes de iniciar o procedimento de CCA para registar uma medição de base para ajudar a identificar qualquer stress grave ou efeitos adversos por alteração do peso corporal após o procedimento de CCA. No dia da estimulação CCA, ligue o CCA expondo a unidade estimuladora a um único pulso de luz infravermelha por uma luz estroboscópica infravermelha portátil e aplique três ou seis horas de estimulação CCA de 10 hertz.
Verifique a estimulação e o animal a cada 30 a 60 minutos. Após o período CCA desejado, desligue a unidade CCA por meio da exposição à luz infravermelha. Ratos submetidos a sete dias de CCA por seis horas por dia exibem biogênese mitocondrial aprimorada no músculo estimulado em comparação com o membro posterior contralateral não estimulado.
Esse aumento na biogênese mitocondrial é indicado pelo aumento da expressão proteica de PGC-1 alfa. O exame das fibras musculares permeabilizadas para medir a capacidade respiratória mitocondrial revela que a ACC resultou em um aumento na capacidade respiratória máxima do músculo em relação ao músculo controle. As populações mitocondriais subsarcolemais e intermiofibrilares aumentaram após sete dias de CCA em comparação com o músculo controle não estimulado.
Adaptações aos sistemas de autofagia e lisossomo também podem ser provocadas pela CCA. Um aumento na abundância de proteínas do fator de transcrição EB, o principal regulador da biogênese lisossômica, é observado após o CCA em todos os momentos. Após este procedimento, outros métodos, como injeções subcutâneas gerais ou intraperitoneais, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como estimativa do fluxo de autofagia com tratamento com colchicina.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como aplicar o modelo atual de atividade contrátil crônica para examinar as alterações fenotípicas musculares após o treinamento de resistência.
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Visão Geral
Este protocolo descreve o uso do modelo de atividade contrátil crônica do exercício para observar as adaptações induzidas por estimulação no músculo esquelético da pata traseira do rato. Este modelo permite aos pesquisadores estudar as adaptações fenotípicas do músculo esquelético em um curto período de tempo, fornecendo insights sobre a fisiologia muscular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Fisiologia Muscular
- Ciência do Exercício
- Adaptações ao Treinamento
Contexto
- O modelo de atividade contrátil crônica é eficaz para estudos in vivo.
- Este modelo pode revelar adaptações em um curto período de sete dias.
- Ele aborda questões fundamentais na biogênese mitocondrial e na autofagia.
- A estimulação muscular crônica pode ajudar a mitigar a fraqueza muscular relacionada ao envelhecimento.
Objetivo do Estudo
- Observar as adaptações do músculo esquelético aos estímulos do treinamento físico.
- Investigar os efeitos de um protocolo de treinamento de seis semanas em um período de tempo reduzido.
- Ampliar a compreensão das adaptações celulares associadas ao exercício.
Métodos Utilizados
- Modelo de atividade contrátil crônica para estimulação muscular.
- Observação de adaptações específicas do músculo.
- Técnicas de estimulação elétrica envolvendo o nervo peroneal comum.
- Avaliação das respostas mitocondriais e de autofagia.
Resultados Principais
- Adaptações significativas do músculo esquelético observadas em até sete dias.
- Biogênese mitocondrial aprimorada observada em resposta à estimulação.
- Evidência de alterações celulares relacionadas à autofagia.
- Implicações terapêuticas potenciais para a atrofia muscular no envelhecimento.
Conclusões
- O modelo de atividade contrátil crônica é uma ferramenta valiosa para o estudo das adaptações musculares.
- Observações de curto prazo podem fornecer insights significativos sobre a fisiologia muscular.
- Pesquisas futuras podem explorar aplicações terapêuticas para a fraqueza muscular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O modelo de atividade contrátil crônica permite uma avaliação rápida das adaptações fenotípicas do músculo esquelético, oferecendo uma linha do tempo comprimida para avaliar alterações moleculares induzidas pelo exercício. Essa abordagem auxilia na validação de alvos em fisiologia muscular ao isolar os efeitos específicos da contração de confundidores sistêmicos, aumentando a confiança preditiva em estudos pré-clínicos de vias metabólicas e relacionadas à atrofia. A utilidade do modelo no estudo da biogênese mitocondrial e da autofagia o posiciona como uma ferramenta mecanicista de redução de riscos para programas iniciais de descoberta voltados à saúde muscular e ao envelhecimento.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmácia
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas mediante a indução de adaptações específicas ao músculo, independentemente de fatores humorais ou neurológicos.
- Valor Operacional: Alcança alterações fenotípicas que normalmente exigem seis semanas de treinamento em apenas sete dias, acelerando estudos de engajamento de alvos.
- Valor Traducional: Apoia a validação funcional de alvos envolvidos nas vias de biogênese mitocondrial e autofagia, relevantes para doenças metabólicas e sarcopenia.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para ensaios: Gera sistemas biológicos quantificáveis com capacidade respiratória mitocondrial aumentada e expressão de PGC-1α para triagem de compostos em etapas subsequentes.
- Reprodutibilidade: Parâmetros padronizados de estimulação (10 Hz, 3–6 horas/dia) permitem a indução consistente de adaptações mitocondriais subsarcolemal e intermiofibrilar.
- Escalabilidade: O implante cirúrgico de bobinas de estimulação crônica permite o monitoramento longitudinal e a coleta repetida de tecidos ao longo dos grupos de estudo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Modela adaptações ao treinamento de resistência aplicáveis à avaliação pré-clínica de intervenções para atrofia muscular e fraqueza relacionada ao envelhecimento.
- Redução Mecanística de Riscos: Permite a avaliação do fluxo de autofagia e da biogênese lisossomal por meio da ativação de TFEB, apoiando estudos de modulação de alvos terapêuticos.
- Confiança Preditiva: Relaciona protocolos de estimulação aguda a fenótipos adaptativos crônicos, melhorando a transposição de candidatos miméticos ao exercício.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para programas que investigam compostos miméticos do exercício ou reguladores específicos do músculo.
- Biologia da Descoberta: Facilita a verificação de hipóteses sobre vias de sinalização induzidas pela contração, isolando respostas musculares diretas à estimulação crônica.
- Triagem: Produz tecido muscular padronizado e estimulado, adequado para ensaios ex vivo que medem a capacidade respiratória e marcadores proteicos de adaptação.
- Análises: Permite a avaliação quantitativa da biogênese mitocondrial (por meio de PGC-1α) e da autofagia (por meio de TFEB) como indicadores farmacodinâmicos.
- Pesquisa Translacional: Conecta respostas à estimulação aguda a estados adaptativos crônicos, apoiando a modelagem de resposta à dose em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma cirúrgica e de estimulação reutilizável para testes iterativos de múltiplos compostos ou manipulações genéticas em diferentes estudos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao distinguir adaptações musculares autônomas celulares dos efeitos sistêmicos do exercício.
- Valor Operacional: Permite a indução reprodutível e eficiente no tempo de adaptações mitocondriais e lisossomais, minimizando o uso de animais e a duração do estudo.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguimento ou interrupção ao fornecer dados fenotípicos precoces e específicos da contração antes de investir em estudos de eficácia de longo prazo.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos que visam vias metabólicas musculares por meio da validação rápida da modulação do alvo.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em microcirurgia em roedores, particularmente para a identificação e manipulação precisas do nervo peroneal comum.
- Depende de instrumentação especializada, incluindo unidades estimuladoras, sistemas de ativação por infravermelho e interfaces de eletrodos com fios soldados.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos cirúrgicos, parâmetros de estimulação e momentos da coleta de tecidos para garantir consistência entre os animais.
- Envolve considerações de adaptação ao transladar o modelo para diferentes grupos musculares ou espécies, devido à variabilidade na acessibilidade dos nervos e no posicionamento da bobina.
- É limitado pela curva técnica de aprendizado associada à sutura da bobina e ao posicionamento do eletrodo próximo ao nervo, o que exige habilidade consistente do operador para manter a fidelidade da estimulação.
