Análise da disfunção contrátil cardíaca e dos transientes de Ca²⁺ em miócitos de roedores

Esta abordagem detecta alterações na função contrátil durante o desenvolvimento da insuficiência cardíaca. A resposta funcional dos miócitos aos neurohormônios e potenciais agentes terapêuticos também pode ser rastreada. O posicionamento do miócito pode ser prático, mas é essencial para a obtenção de imagens consistentes do comprimento do sarcômero.

Demonstrando o procedimento está Margaret Westfall, professora associada e pesquisadora principal do laboratório. Antes de iniciar o experimento, pré-aqueça um pacote de gel e um meio em uma incubadora a 37 graus Celsius por 30 minutos. Ligue os componentes da plataforma de função contrátil conforme mencionado no manuscrito e monte a tubulação na bomba peristáltica.

Em seguida, transfira o pacote de gel pré-aquecido para o suporte do tubo e ligue o vácuo na potência para o estimulador celular. Coloque um tubo de 50 mililitros com meio no suporte do tubo isolado para iniciar a perfusão a 0,5 mililitros por minuto através do tubo da bomba peristáltica. Em seguida, adicione dois mililitros de meio pré-aquecido a um pequeno barco de pesagem e transfira uma folha de cobertura contendo miócitos da câmara de estimulação para o barco de pesagem.

Devolver a câmara de estimulação à incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Remova o deslizamento da tampa do barco de pesagem e limpe suavemente a parte inferior antes de transferi-lo para uma câmara de deslizamento da tampa recém-untada e adicionar uma gota de mídia ao deslizamento da tampa. Coloque um suporte de eletrodo de platina sobre o deslizamento da tampa, em seguida, coloque um novo deslizamento da tampa sobre o topo com pinça e coloque um suporte superior sobre o sanduíche deslizante da tampa.

Instale dois ou quatro parafusos de cabeça de panhead número zero para terminar de montar a câmara. Na bomba peristáltica, quando o meio estiver presente em toda a tubulação, prenda a tubulação ao pré-aquecedor e o pré-aquecedor à câmara deslizante da tampa. Em seguida, inicie a perfusão a 0,5 mililitros por minuto e coloque um lenço de papel abaixo da câmara para garantir que não haja vazamentos.

Depois de colocar a câmara de deslizamento da tampa no adaptador de estágio do microscópio, ligue o sistema de aquecimento e equilibre o conjunto por cinco a 10 minutos para atingir uma temperatura constante do meio de 37 graus Celsius no centro da câmara. Observe o meio perfundido sendo coletado na extremidade oposta da câmara com tubos conectados a um sistema de vácuo. Durante o tempo de equilíbrio, visualize os miócitos com a objetiva de imersão em água de 40x no microscópio.

Para ativar o estimulador de ritmo, defina a tensão para 35 a 40 volts e ajuste a frequência de estimulação para 0,2 hertz para otimizar a função contrátil e a sobrevivência dos miócitos. Para coletar traços de encurtamento de sarcômero, abra o software no computador e selecione ok, arquivo e novas guias. Prepare um modelo de tela selecionando rastreamentos, edite limites de usuário e comprimento de sarcômero.

Registre os traços de comprimento do sarcômero com o arquivo e novas abas, identifique um miócito em contração e posicione o miócito ao longo do eixo longitudinal da câmera para que o padrão de estriação seja vertical. Use o mouse do computador para colocar a região de interesse ou a caixa ROI sobre o miócito. Selecione coletar e iniciar para registrar a função contrátil.

Registre o encurtamento por 60 segundos de cada miócito em baixas frequências de estimulação de 0,5 hertz. Registre o encurtamento do sarcômero de cinco para 10 células por folha de cobertura. Para medir o encurtamento em uma faixa de frequências, coloque os miócitos em cada frequência para obter o encurtamento em estado estacionário antes do registro.

Dobre a taxa de perfusão e comece a gravar 15 a 20 segundos após a estimulação em uma nova frequência na faixa de 0,2 a dois hertz e registre não mais do que dois miócitos por deslizamento de cobertura para encurtar toda a faixa dada de frequências de estimulação. Registre pelo menos sete contrações por célula para obter dados médios de sinal confiáveis. Selecione o arquivo, escolha um rastreamento gravado e, em seguida, selecione abrir.

Selecione a guia um do rastreamento base e, em seguida, defina o painel amarelo na parte superior do rastreamento para obter o comprimento do sarc. Prepare um modelo de análise com opções de análise transitória monotônica de operações e marca de evento TTL na definição da caixa T Zero nas opções necessárias no menu. Salve essas opções de análise selecionando modelos e salve o modelo de análise com um identificador.

Carregue o modelo de análise antes de analisar cada rastreamento. Para analisar os dados, selecione marcas, porta, adicione transiente e converta a partir da marca de evento e do intervalo de análise. Defina o intervalo de tempo de menos 0,01 a 1,20 segundos para miócitos com ritmo de 0,2 hertz.

Selecione um intervalo de tempo mais curto para miócitos estimulados em frequências mais altas. Selecione operações e eventos médios para produzir uma gravação média de sinal abaixo do rastreamento de base original. Em seguida, selecione a guia um do traço médio do sinal e, em seguida, vá para marcas no menu superior, seguidas por adicionar transiente, escolha operações e análise transiente monotônica para exibir os valores médios do sinal para os parâmetros de sarcômero de linha de base no painel de exibição de média do sinal.

Selecione exportar análise transitória monotônica e corrente da área de transferência e transferir a análise transitória de sarcômero para uma planilha para a análise composta de miócitos múltiplos. Para copiar o rastreamento médio do sinal, selecione exportar, rastrear atual, depois as guias da área de transferência e das opções em ordem e defina as casas decimais como cinco. Escolha o delimitador de guias e clique em OK.

Acelere os traços médios do sinal para cada registro de miócitos em uma segunda planilha. O estudo mostrou que a sobrecarga pressórica ou PO, reduziu a função contrátil dos miócitos quando comparada ao grupo sham. No entanto, quatro dias após a transferência gênica da troponina cardíaca IT 144D ou cTnIT144D, a capacidade contrátil nos miócitos PO retornou a níveis simulados, indicando que a função dos miócitos poderia ser restaurada.

Nos estudos iniciais, a transferência gênica de cTnIT144D aumentou o pico de encurtamento e níveis elevados de cálcio diastólico em comparação com CTnI. Ajustes finos no posicionamento do miócito cardíaco são frequentemente necessários para obter traços claros de encurtamento. Este protocolo também pode ser realizado em miócitos cardíacos carregados com corantes fluorescentes sensíveis ao cálcio, como o Fura-2 AM, para detectar transientes de cálcio, além de encurtamento.