Fabricação de uma matriz de microambiente celular Artificial multiplexado

Este método pode ajudar com uma questão-chave no campo da engenharia de células-tronco, como como o microambiente celular altera os fenótipos e a função celular. A principal vantagem desta técnica é que ela fornece o ambiente múltiplo criado artificialmente para as células em uma única placa, o que você não poderia realizar com um método convencional em placa de micro-contato, demonstrando que este procedimento será Koki Yoshimoto e Risako Sakai, técnicos de nosso laboratório. Depois de criar imagens 3D de máscaras para matrizes de nanofibras e moldes de estruturas microfluídicas de acordo com o protocolo de texto.

Use uma impressora 3D para imprimir as máscaras e o molde. Para preparar soluções de polímero para eletrofiação, dilua 13% de líquido PMGI com tetrahidrofurano a nove por cento. Dissolva 0,08 gramas de PS em uma proporção de um para um volume de THF para dimetilformamida e use um regente líquido para elevar o volume até o mililitro final de oito por cento de peso por volume de solução PS.

Dissolva 0,1 grama de GT em água, ácido ácido e acetato de etila e use a solução solvente misturada para aumentar o volume até o mililitro final de 10 por cento em peso por volume de solução GT. Em seguida, usando uma máquina de pulverização catódica, deposite uma camada de platina de cinco nanômetros de espessura em uma placa de base de poliestireno que serve como um cátodo na configuração de eletrofiação. Carregue cada solução de polímero em uma seringa de cinco mililitros equipada com uma agulha romba de aço inoxidável calibre 23.

Em seguida, ancore as seringas em uma bomba de seringa a 12 centímetros de distância do coletor do dispositivo eletrogiratório. Conecte a agulha da seringa a um alto voltage fonte de alimentação e ajuste-o para 11 quilovolts. Em seguida, defina a taxa de bombeamento para 20 mililitros por hora e mantenha a temperatura e a umidade em 30 graus Celsius e menos de 30% em volume, respectivamente.

Agora coloque a máscara na placa de base. Em seguida, através dos orifícios da máscara, fabrique nanofibras na placa de base com densidades distintas, alterando o tempo de eletrofiação. Remova a máscara da placa de base e repita a fabricação da nanofibra.

Quando a matriz estiver completa, coloque-a em um dessecador a 25 graus Celsius por 16 horas para evaporar o solvente restante. Para reticular as nanofibras GT, trate-as com EDC 0,2 molar e NHS 0,2 molar em etanol. E incube as amostras a 25 graus Celsius por quatro horas.

Para enxaguar as nanofibras GT, use etanol a 99,5% duas vezes e seque as placas a vácuo a 25 graus Celsius por 16 horas. Para fabricar estruturas microfluídicas, misture 2 gramas de agente de cura PDMS e 20 gramas de base PDMS. Em seguida, despeje a mistura pré-PDMS no molde fabricado.

Em um dessecador, desgaseifique a mistura pré-PDMS por 30 minutos. Em seguida, catalise a mistura pré-PDMS em um forno a 65 graus Celsius por 16 horas. Para montar as matrizes de Macme, retire a estrutura PDMS curada do molde e use 70% de etanol para limpá-la.

Em seguida, descarregue a coroa atmosférica na parte inferior da estrutura do PDMS. Monte rapidamente a estrutura PDMS com a matriz de nano fibras. Em seguida, asse o conjunto no forno a 65 graus Celsius por dois dias.

Usando DPBS, lave H9HESCs cultivados em um prato de 35 milímetros. Em seguida, adicione 0,5 mililitros de protease leve de tripsina recombinante ao prato e incube-o a 37 graus Celsius por um minuto. Aspirar cuidadosamente a mistura de protease sobrenadante.

Adicione imediatamente o meio HPSC e dispense suavemente o meio contra a superfície do prato repetidamente para dissociar as células. Em seguida, transfira as células destacadas para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue o tubo com gravidade de 200 vezes por três minutos.

Aspirar o sobrenadante e suspender as células em meio HPSC pré-aquecido. Em seguida, pipete 12 microlitros da suspensão celular em cada câmara microfluídica. Depois de marcar fluorescentemente as células de acordo com o protocolo de texto, retire a estrutura microfluídica do PDMS da matriz Macme.

Em seguida, remova o PBMS residual da matriz Macme, adicione 90% de glicerol em PBS às células coradas e aplique uma lamínula. Finalmente, coloque a placa de cabeça para baixo no palco de um microscópio de fluorescência invertida. E use o software de imagem do microscópio para adquirir imagens coloridas de 12 bits.

Aqui são mostradas imagens de imunofluorescência de H9HPSCs cultivadas em alta densidade de semeadura inicial em nanofibras de gelatina e coradas com 3 marcadores fenotípicos celulares. A análise SOM foi usada para converter conjuntos de dados multiparamétricos de alta dimensão em mapas 2D de baixa dimensão para comparar a homogeneidade e heterogeneidade dos níveis de expressão para os quatro marcadores fenotípicos em cada conjunto de dados e o agrupamento hierárquico não supervisionado foi realizado para os nós SOM. Conforme indicado aqui, todos os grupos exibiram maior expressão de OCT4 do que a observada na matriz de gel da membrana basal, ou MG. O grupo um mostrou altos sinais de EdU, indicando que a maioria das células estava proliferando ativamente.

Assim, os microambientes do grupo um foram adequados para a manutenção de HPSC porque as HPSCs indiferenciadas proliferam rapidamente quando as fases de intervalo do ciclo celular são encurtadas. O grupo dois incluiu células semeadas em uma densidade inicial insuficiente e células cultivadas em andaimes GT 2D que não suportaram a auto-renovação de HPSC. Por exemplo, o sinal EdU desta amostra foi perdido e os níveis de anexina V foram ligeiramente aumentados, indicando que as células perderam sua estaminalidade e gradualmente se tornaram apoptóticas.

O PMGI MidNF HighCD do grupo três, que representa os microambientes que compõem as matrizes de nanofibras do PMGI, apresentou as maiores variações nos sinais de OCT4 e EdU em comparação com as outras condições. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para o pesquisador na área de células STEM explorar a engenharia de tecidos e triagem avançada.