Identificação de vias hospedeiras alvo de proteínas efetoras bacterianas usando toxicidade de levedura e telas supressoras
25 de outubro de 2019
Patógenos bacterianos secretam proteínas no hospedeiro que têm como alvo processos biológicos cruciais. Identificar as vias hospedeiras alvo de proteínas efeteroras bacterianas é fundamental para abordar a patogênese molecular. Aqui, um método usando um supressor de levedura modificado e tela de toxicidade para elucidar as vias hospedeiras alvo de proteínas efívoras tóxicas é descrito.
Bactérias intracelulares secretam proteínas efeitos no hospedeiro que podem manipular caminhos biológicos para promover a sobrevivência do patógeno. Revelar alvos hospedeiros de efeitos é essencial para entender patógenos intracelulares como clamídia trachomatis. A toxicidade da levedura e as telas supressoras podem fornecer informações fundamentais sobre o alvo biológico natural das proteínas de efeitos bacterianos e podem ser particularmente úteis quando um parceiro de ligação é desconhecido.
Demonstramos a toxicidade da levedura e os ensaios supressores aqui para triagem de proteínas efeitos de clamídia trachomatis, mas esta técnica também tem sido usada para caracterizar os efeitos Legionella pneumophila e Coxiella burnetii. Comece inoculando cinco mililitros de caldo único com a única colônia de levedura transformada com a proteína do efeito contendo plasmídeo. Use a levedura transformada apenas com o vetor como um controle negativo e incubar o inóculo durante a noite a 30 graus Celsius enquanto treme.
No dia seguinte, adicione 180 microliters de água estéril aos poços A2 através de A6 de uma placa de 96 poços. Vórtice a cultura da noite para o dia e adicionar 180 microliters de levedura ao bem A1. Em seguida, diluir o fermento nos poços com água. Use uma pipeta multicanal para detectar cinco microliters de cada diluição em glicose de gota única e placas de ágar de gota única e incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 horas.
Após a incubação, avalie visualmente a toxicidade comparando o crescimento da levedura expressando a proteína effectora cultivada na mídia que contém galactose ao crescimento da levedura expressando apenas o vetor. Inocular 100 mililitros do caldo único com um mililitro do estoque de levedura previamente preparado e incuba-lo por 16 a 24 horas a 30 graus Celsius com agitação a 150 RPM. No dia seguinte, adicione os 100 mililitros da cultura da noite para o dia a 900 mililitros de caldo de gota único pré-aquecido e incubar o frasco por quatro a cinco horas a 30 graus Celsius enquanto treme.
Após a incubação, pelota a cultura a 6.000 vezes g por 10 minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 250 mililitros de água estéril. Repita a centrifugação e descarte o supernatante.
Em seguida, resuspend a pelota em 250 mililitros de um acetato de lítio milimiliar. Pelota a cultura por centrifugação, remova o acetato de lítio e resuspenja a pelota em 9,6 mililitros de 50%PEG 3350. Em seguida, adicione reagentes de transformação como descrito no manuscrito e ajuste o volume para 15 mililitros com água estéril invertendo suavemente para misturar.
Incubar a mistura a 30 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, adicione 750 microliters de DMSO e incubar em um banho de água a 42 graus Celsius por mais 30 minutos. Adicionar o DMSO antes do choque térmico é crucial para alcançar uma alta eficiência de transformação.
Após a incubação, pelota a levedura por centrifugação a 3.000 vezes g por cinco minutos. Descarte o supernatante e lave a pelota com 10 mililitros de água estéril e depois repita a centrifugação para pelotar o fermento. Resuspend a pelota em oito mililitros de água.
Determine a eficiência de transformação diluindo a amostra de um a 10 e emplacando 100 microliters de cada diluição em ágar duplo. Em seguida, a placa 200 microliters da amostra em placas de ágar de gota dupla e incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 a 96 horas ou até que as colônias apareçam. Uma vez que as colônias apareceram, remendá-las em ágar galactose dupla e incuba-los por mais 24 a 48 horas.
Use parte do patch para inocular cinco mililitros de caldo duplo e incubar o inóculo durante a noite a 26 graus Celsius com agitação a 150 RPM. No dia seguinte, adicione 180 microliters de água estéril a cinco poços de uma placa de 96 poços começando com bem A2. Vórtice a mistura de cultura da noite para o dia. Adicione 180 microliters de levedura ao poço A1 e dilui-o em série usando a água nos poços A2 a A6. Detectar cinco microlitros de cada diluição em glicose de gota única e placas de ágar de gota única, certificando-se de incluir o efeito tóxico sozinho como controle.
Incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 horas e comparar o crescimento da levedura com efeito tóxico sozinho com o crescimento da levedura com o supressor potencial. Para confirmar supressores que demonstraram menor toxicidade em comparação apenas com o efeito tóxico, isole o plasmídeo de acordo com as instruções do manuscrito e transforme-o na levedura tóxica. Inoculado caldo de glicose duplo com uma colônia da placa de transformação.
Incuba-o durante a noite e localiza em glicose dupla e ágar galactose para confirmar a supressão da toxicidade. Antes de realizar a tela supressora de levedura, as proteínas de interesse do efeito foram testadas para toxicidade na levedura. A proteína de interesse foi expressa na levedura sob o controle de um promotor indutível galactose e o crescimento da galactose foi comparado ao crescimento da glicose.
Quando o CT229 foi testado para toxicidade, foram observadas colônias menores e supressão de crescimento. O ideal é que uma diminuição de dois a três logs seja observada para prosseguir com as telas supressoras de levedura. A tela do supressor foi conduzida transformando a cepa tóxica com a biblioteca genômica de levedura pYAP 13 e emplacando os transformadores no ágar galactose.
Os clones supressores obtidos foram vistos em ágar de dupla desistência para confirmar a supressão da toxicidade. Supressores pSup1 e pSup2 suprimiram a toxicidade da proteína effectora, enquanto pSup3 não. Esses procedimentos requerem atenção cuidadosa aos detalhes, além de trabalhos preparatórios críticos, incluindo ter grandes quantidades de mídia e placas prontas antes de realizar o experimento.
Uma vez identificados os supressores, experimentos podem ser realizados para verificar interações com o efeito de interesse, incluindo pull downs, imunofluorescence colocalization, effector knockout ou knockdown de fatores hospedeiros identificados nas telas. O desenvolvimento desta técnica para os efeitos da Clamídia permitiu a caracterização preliminar acelerada de proteínas efeitosoras e ajudou a concentrar nossos esforços na elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes que mediam as interações de patógenos hospedeiros.
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Visão Geral
Este artigo descreve um método para identificar vias hospedeiras alvejadas por proteínas efetoras bacterianas tóxicas utilizando ensaios de toxicidade e supressão em levedura. Compreender essas interações é essencial para abordar a patogênese molecular em bactérias intracelulares, como Chlamydia trachomatis.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Microbiologia
- Interações patógeno-hospedeiro
- Biologia celular
Contexto
- Patógenos bacterianos secretam proteínas efetoras que manipulam vias biológicas do hospedeiro.
- A identificação dessas vias é essencial para compreender as doenças causadas por bactérias intracelulares.
- Modelos de levedura podem ser utilizados para investigar os efeitos dessas proteínas efetoras.
- Este método foi aplicado a diversos patógenos, incluindo Chlamydia trachomatis.
Objetivo do Estudo
- Elucidar as vias do hospedeiro que são alvejadas por proteínas efetoras bacterianas tóxicas.
- Fornecer informações sobre os mecanismos moleculares da patogênese.
- Demonstrar a utilidade de telas de toxicidade e supressão em levedura nesta área de pesquisa.
Métodos Utilizados
- Inoculação de levedura transformada com plasmídeos de proteínas efetoras.
- Uso de controles negativos com levedura transformada apenas com vetor.
- Incubação das culturas a 30 graus Celsius sob agitação.
- Análise do crescimento da levedura e da toxicidade para identificar interações de proteínas efetoras.
Resultados Principais
- Identificação bem-sucedida de vias hospedeiras afetadas por proteínas efetoras de Chlamydia trachomatis.
- Demonstração da eficácia de triagens em levedura no estudo de efetores bacterianos.
- Informações sobre os alvos biológicos de diversos patógenos bacterianos.
- Aplicações potenciais deste método para outras bactérias intracelulares.
Conclusões
- Ensaios de toxicidade em levedura e triagens de supressores são ferramentas valiosas para o estudo de proteínas efetoras bacterianas.
- Essa abordagem aprimora o entendimento das interações entre patógeno e hospedeiro.
- Pesquisas futuras utilizando este método poderiam levar a novas estratégias terapêuticas contra infecções bacterianas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A identificação das vias do hospedeiro manipuladas por proteínas efetoras bacterianas é fundamental para reduzir os riscos na validação de alvos na descoberta de agentes anti-infecciosos. Ensaios de toxicidade e supressão em levedura oferecem uma abordagem funcional, baseada em fenótipos, para identificar alterações na biologia do hospedeiro quando ensaios tradicionais de ligação falham. Isso permite obter insights mecanicistas sobre fatores de virulência de patógenos, apoiando a confiança inicial no alvo e a priorização de portfólios para patógenos intracelulares.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao vincular a toxicidade do efetor a vias hospedeiras específicas por meio da identificação de supressores.
- Valor Operacional: Permite a validação funcional de alvos quando as proteínas efetoras não possuem parceiros de ligação detectáveis ou interagem com proteínas hospedeiras multifuncionais.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos mecanicistas ao revelar perturbações em nível de via, em vez de interações proteicas isoladas.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera linhagens de levedura validadas que expressam proteínas efetoras para triagem reprodutível de toxicidade.
- Saída Quantitativa: Mede a magnitude do defeito de crescimento (por exemplo, redução de dois a três log) como limite para avançar para triagens de supressores.
- Escalabilidade: Utiliza formatos de 96 poços e spotting por diluição seriada para avaliação de alto rendimento de clones supressores.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para Doenças: Aplica-se a patógenos intracelulares como Chlamydia trachomatis, Legionella pneumophila e Coxiella burnetii, apoiando o alinhamento translacional de biomarcadores.
- Continuidade Pré-clínica: Identifica fatores hospedeiros que, quando suprimidos, resgatam a toxicidade de efetores, permitindo validação complementar por meio de ensaios de precipitação, colocalização ou estudos com genes knockout.
- Avanço com Ajuste de Risco: Concentra os esforços em efetores com modulação de vias confirmada, reduzindo a perda biológica em estágios tardios.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial de descoberta para orientar a identificação de compostos ativos, conectando a expressão de efetores à interrupção da via do hospedeiro, permitindo a seleção de alvos baseada em dados.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses ao associar a expressão de efetores a defeitos de crescimento em levedura, indicando interferência na via.
- Triagem: Fornece cepas tóxicas prontas para ensaio e bibliotecas de supressores para identificar fatores do hospedeiro que resgatam o fenótipo.
- Análises: Oferece leituras quantitativas de crescimento em meios seletivos para comparar a toxicidade dos efetores e a eficácia dos supressores.
- Pesquisa Translacional: Conecta supressores identificados em levedura a homólogos mamíferos para validação pré-clínica em sistemas relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para triagem de bibliotecas de efetores em múltiplos patógenos intracelulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio da investigação funcional de vias biológicas.
- Valor Operacional: Fluxos de trabalho padronizados para triagem de toxicidade e supressores, com limiares de crescimento definidos.
- Valor Estratégico: Decisões aprimoradas de prosseguir ou interromper com base na filtragem de efetores que não apresentam impacto mensurável sobre vias do hospedeiro.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco de alvos efetores com base na modulação validada de vias biológicas.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em clonagem molecular com levedura, expressão induzível por galactose e transformação de biblioteca de plasmídeos.
- Depende de instrumentação para manipulação estéril de culturas, centrifugação e incubação a 30°C com agitação.
- Necessita padronização entre equipes nos procedimentos de preparo de meios, aplicação em placas e critérios de pontuação de toxicidade.
- As considerações para adaptação incluem compatibilidade de promotores, limiares de toxicidade do efetor e validação de supressores em sistemas de mamíferos.
- As limitações práticas incluem a necessidade de grandes volumes de meio e placas, além da possibilidade de falsos negativos caso a expressão do efetor seja tóxica para as linhagens da biblioteca de levedura.
