Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid
27 de julho de 2011
Aqui nós descrevemos uma tela superexpressão plasmídeo em Saccharomyces cerevisiae, Usando uma biblioteca vestiu plasmídeo e uma alta taxa de transferência de protocolo de transformação de levedura com um robô para manipulação de líquidos.
O objetivo geral deste procedimento é transformar células de levedura com uma biblioteca em matriz de DNAs plasmidiais. Isso é realizado primeiramente cultivando-se uma quantidade apropriada de células de levedura. As células de levedura são então tratadas com acetato de lítio para torná-las competentes para a transformação de DNA.
Em seguida, transforme as células competentes e misturando-as com DNA. O passo final do procedimento é selecionar e analisar os transformantes. Em última instância, podem ser obtidos resultados que demonstram os efeitos do DNA plasmidial sobre fenótipos de levedura por meio de ensaios de plaqueamento em levedura e/ou microscopia.
A principal vantagem desta técnica em relação a protocolos existentes, como as transformações padrão em levedura, é que ela permite a transformação de um grande número de plasmídeos diferentes em células de levedura de forma automatizada. Este protocolo de transformação de levedura de alto rendimento foi projetado para 10 placas de 96 poços, mas pode ser ampliado ou reduzido conforme necessário. Para experimentos em maior escala, a chave para o sucesso é manter todas as placas e reagentes organizados.
Uma vez iniciado o experimento, para evitar confusão, um manipulador automático de placas líquidas Biobot Rapid será utilizado neste protocolo. Para começar, alíquotas de cinco a dez microlitros de DNA plasmídico de uma biblioteca de plasmídeos de levedura em matriz serão distribuídas em cada poço de placas de fundo redondo com 96 poços. Coloque as placas de 96 poços descobertas dentro de uma cabine de segurança biológica ou capela de exaustão limpa durante a noite para secagem.
Em seguida, inocular 200 mililitros de meio de peptona de levedura e dextrose ou meio YPD com uma linhagem de interesse em um frasco Lin Meyer de 500 mililitros com barreiras e incubar durante a noite a 30 graus Celsius com agitação. Na manhã seguinte, diluir a linhagem de interesse até uma DO600 de 0,1 em dois litros de meio YPD para crescimento ideal. Cultivar culturas de até um litro em frascos separados de 2,8 litros com barreiras.
Agite os frascos por quatro a seis horas a 30 graus Celsius até que as culturas atinjam uma DO 600 de 0,8 a 1,0. Quando a cultura de levedura atingir uma DO 600 de 0,8 a 1,0, recolha as células por centrifugação. Encha quatro tubos cónicos descartáveis de 225 mililitros com a cultura e centrifugue a 3000 RPM por cinco minutos em uma centrífuga de bancada.
Descarte o sobrenadante S de cada tubo. Adicione mais cultura aos mesmos tubos e centrifugue novamente, repetindo conforme necessário até que todas as células sejam colhidas. Lave cada pellet celular em 50 mililitros de água destilada autoclavada e ressuspenda por vortexagem.
Combine as células em um tubo cônico de 225 mililitros e centrifugue a 3000 RPM durante cinco minutos. Após a remoção do sobrenadante S, lave as células com 100 mililitros de solução de acetato de lítio. Centrifugue novamente a 3000 RPM durante cinco minutos.
Remova o SNA e ressuspenda o pellet celular em 70 mililitros de solução de acetato de lítio. Vortexie em alta velocidade por cerca de 30 segundos até que o pellet seja completamente ressuspenso. Incube sob agitação a 30 graus Celsius por 30 minutos.
Em seguida, adicione beta me capto etanol até atingir 0,1 molar e incube sob agitação a 30 graus Celsius por mais 30 minutos. Após a incubação de 30 minutos, adicione dois mililitros de DNA de esperma de salmão fervido e resfriado à mistura celular. Despeje a mistura celular em uma placa de poço simples autoclavável e, em seguida, remova qualquer precipitado que se forme, pois isso pode interferir com a pipetagem posterior.
Usando o biobot rapid plate, alíquota 50 microlitros da mistura celular para cada poço das quatro placas de 96 poços previamente preparadas contendo DNA plasmidial. Não misture. Incube as placas à temperatura ambiente por 30 minutos sem agitação enquanto as células estão em incubação.
Prepare 200 mililitros de solução de acetato de lítio PEG DMSO. Combine 160 mililitros de PEG 33 a 50%, 20 mililitros de DMSO e 20 mililitros de acetato de lítio um molar. É importante que esta solução seja preparada imediatamente antes do uso.
Adicione 125 microlitros da solução de acetato de lítio PEG DMSO a cada amostra. Misture bem aspirando e dispensando a suspensão celular oito vezes. Incube à temperatura ambiente por 30 minutos sem agitação.
Em seguida, submeta as células a choque térmico a 42 graus Celsius por 15 minutos em um incubador seco; não empilhe as placas após o choque térmico, centrifugue as placas utilizando adaptadores de centrífuga para acomodar as placas de 96 poços. Após a centrifugação, remova a solução de PEG invertendo as placas sobre um recipiente de resíduos. Em seguida, seque as placas invertidas em papel toalha.
Para remover o líquido residual, as células permanecerão no fundo das cavidades. Lave as células adicionando 200 microlitros de meio mínimo a cada uma. Em seguida, centrifugue novamente as placas.
Remova o sobrenadante invertendo o recipiente sobre um balde de resíduos e seque com papel toalha. Adicione 200 microlitros de meio mínimo a cada poço com uma placa rápida e incube a 30 graus Celsius por dois dias sem agitação. Após dois dias, pequenas colônias de células devem começar a se formar no fundo de cada poço transformado com sucesso.
Para preparar o ensaio de Spatting, primeiro distribua 200 microlitros de meio mínimo baseado em OSE em cada poço de uma nova placa de fundo plano com 96 poços. Em seguida, misture cada poço da placa de transformação aspirando e dispensando a suspensão celular oito vezes com uma pipeta rápida.
Inocule cada poço da placa de rafinose com cinco microlitros da mistura celular da placa de transformação, incube a 30 graus Celsius por um dia. No dia seguinte, pequenas colônias devem estar presentes na base de cada poço.
Iremos realizar o ensaio de spotting na câmara de fluxo laminar, esterilizando um porta-pinos de 96 pontas, replicador ou frogger por meio da chama. Misture as colônias com o frogger e, em seguida, aplique as colônias em placas de meio seletivo. Após a aplicação, deixe as placas secarem na câmara de fluxo laminar por cinco a dez minutos.
Incube as placas a 30 graus Celsius por dois a três dias. São apresentados aqui resultados representativos de uma triagem de superexpressão de plasmídeo em levedura para identificar supressores e potenciadores da toxicidade da TDP-43. A TDP-43 é uma proteína humana implicada na patogênese da esclerose lateral amiotrófica ou doença de Lou Gehrig. A expressão da TDP-43 em células de levedura resulta em agregação e citotoxicidade.
Essas placas exibem colônias com um plasmídeo de T DP 43 indutível por galactose integrado, que também foram transformadas com plasmídeos da biblioteca de expressão ORF de genes flex. As colônias aqui aparecem com coloração vermelha porque a linhagem possui, por acaso, uma mutação que resulta no acúmulo de um pigmento vermelho. A placa à esquerda contém glicose, que reprime a expressão de T DP 43 ou dos plasmídeos de genes flex.
A placa à direita contém galactose, que induz a expressão de TDP 43 e das OS no plasmídeo do gene flex. A ponta de seta verde indica uma colônia transformada com um plasmídeo que suprime a toxicidade do TDP 43, conforme indicado pelo crescimento mais rápido e colônias mais densas. A ponta de seta vermelha indica uma colônia transformada com um plasmídeo que potencializa a toxicidade do TDP 43, conforme indicado pelo crescimento mais lento e colônias menos densas.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como transformar uma biblioteca de evitamento de DNAs plasmáticos de células.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo detalhado e de alto rendimento para transformar Saccharomyces cerevisiae (levedura brotante) com uma biblioteca de DNA plasmidial em matriz, utilizando um robô de manipulação líquida. O método permite triagens sistemáticas de superexpressão para identificar modificadores genéticos de fenótipos, como a toxicidade associada a proteínas humanas relacionadas a doenças neurodegenerativas propensas à agregação. O protocolo é escalável e adaptável a diversos fenótipos celulares de interesse.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Genética de leveduras
- Triagem de alto rendimento
- Biologia molecular
Antecedentes
- S. cerevisiae é um organismo modelo amplamente utilizado no estudo de processos celulares fundamentais.
- Telas genéticas em levedura elucidaram vias-chave relacionadas a doenças humanas.
- Bibliotecas genômicas de cepas de levedura e plasmídeos permitem a investigação sistemática da função gênica.
- Telas de superexpressão podem identificar modificadores genéticos de fenótipos relacionados a doenças.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um protocolo robusto e escalonável para transformação de levedura em alto rendimento utilizando um robô de manipulação líquida.
- Facilitar telas de superexpressão de plasmídeos com bibliotecas distribuídas em matriz.
- Identificar modificadores genéticos da toxicidade provocada por proteínas humanas com tendência à agregação em levedura.
Métodos Utilizados
- Preparação de células de levedura competentes utilizando tratamento com acetato de lítio.
- Dispensação automatizada de DNA plasmidial e células de levedura em placas de 96 poços usando um robô manipulador de líquidos.
- Transformação por meio de PEG/acetato de lítio/DMSO e choque térmico.
- Seleção e análise de transformantes por meio de ensaios de spotting e microscopia.
Resultados Principais
- Transformação eficiente de levedura com uma biblioteca ampla e ordenada de plasmídeos em formato de alto rendimento.
- Identificação de plasmídeos que suprimem ou potencializam a toxicidade da proteína humana TDP-43 em levedura.
- Demonstração da escalabilidade e adaptabilidade do protocolo para diferentes necessidades experimentais.
- Resultados representativos mostram diferenças fenotípicas claras no crescimento e na densidade das colônias com base nos efeitos dos plasmídeos.
Conclusões
- O protocolo permite triagens genéticas sistemáticas e de alto rendimento em levedura.
- É eficaz para identificar modificadores genéticos de fenótipos complexos, incluindo aqueles relevantes para doenças neurodegenerativas.
- O método é adaptável a uma ampla gama de fenótipos celulares e escalas experimentais.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Telas de superexpressão de plasmídeos em levedura de alto rendimento permitem a identificação sistemática de modificadores genéticos que afetam fenótipos celulares relevantes para doenças humanas. Essa abordagem escalável apoia a validação precoce de alvos e a redução de riscos mecanicistas, aproveitando um modelo eucariótico bem caracterizado. A integração de manipulação automatizada de líquidos acelera os pontos críticos de descoberta e a triagem de portfólios na indústria biofarmacêutica.&D.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação da função gênica e do envolvimento de vias em fenótipos relevantes para doenças.
- Apoia a identificação de supressores e potencializadores genéticos para desvio mecanicista de riscos.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio de triagem sistemática de ganho de função.
- Oferece confiança preditiva para priorização de alvos em sistemas biológicos complexos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara sistemas de levedura validados para fluxos de trabalho de triagem em alto rendimento.
- Padroniza condições de ensaio utilizando manipulação automatizada de líquidos para reprodutibilidade.
- Gera saídas fenotípicas quantitativas para avaliação confiável de compostos ou genética.
- Permite triagem escalável de milhares de plasmídeos em paralelo para geração robusta de dados.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha fenótipos de levedura com mecanismos de doenças humanas para continuidade translacional.
- Apoia a identificação de modificadores genéticos relevantes para modelos de doenças neurodegenerativas.
- Oferece uma plataforma para avanço ajustado ao risco de alvos na validação pré-clínica.
- Oferece valor preditivo de redução de riscos ao modelar a toxicidade de proteínas com tendência à agregação.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de transformação de levedura de alto rendimento conecta a fase inicial de descoberta e a identificação de candidatos promissores ao permitir triagens genéticas sistemáticas com relevância translacional direta.
- Biologia da Descoberta: Apoia a testagem de hipóteses e a clarificação de vias relacionadas aos mecanismos de doenças.
- Triagem: Oferece modelos de levedura prontos para ensaios e reprodutíveis para avaliação em alto rendimento.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de crescimento e densidade de colônias para análise comparativa.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas baseadas em levedura a modelos pré-clínicos de doenças quando alinhadas à toxicidade de proteínas humanas.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade de triagem reutilizável e escalável para diversos desfechos fenotípicos.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e produtividade por meio da automação.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir/interromper e a eficiência do capital ao permitir triagens robustas em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de alvos validados.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em genética de leveduras e protocolos de triagem de alto rendimento.
- Depende do acesso a robótica de manipulação líquida e infraestrutura de placas de 96 poços.
- Necessita padronização entre equipes no preparo do ensaio e na análise de dados.
- Adaptável a diversos fenótipos, mas pode exigir otimização para leituras específicas.
- A escalabilidade e a reprodutibilidade dependem de um rigoroso gerenciamento das placas e reagentes.
