Isolamento de RNA fecal (micro)
28 de outubro de 2020
Este protocolo isola RNA total de alta qualidade de amostras fecais de animais e seres humanos. Um kit comercial de isolamento de miRNA é usado com adaptação significativa para isolar o RNA puro com quantidade e qualidade otimizadas. Os isolados de RNA são bons para a maioria dos ensaios de RNA a jusante, como sequenciamento, micro-array e RT-PCR.
Apresentamos um protocolo de isolamento de RNA de amostras fecais para estudo de microRNAs. Este protocolo pode ser usado para isolar o RNA das fezes com alta qualidade e quantidade. Minimiza os RNAs de micróbios vivos.
É importante enfatizar que o buffer de ligação não é usado neste protocolo. Este protocolo é simples e direto. Comece ressuspendendo 25 a 100 miligramas de amostras fecais em 600 microlitros de 1X DPBS estéril em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.
Incubar o tubo que contém a amostra à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, amasse a mistura com uma ponta de pipeta de um mililitro e vortex bem. Ressuspenda a mistura em um homogeneizador com uma configuração para um ciclo a 4.000 rotações por minuto por 45 segundos para otimizar e aumentar a quantidade e a qualidade do RNA.
Adicione 600 microlitros de solução ácida de fenol clorofórmio à amostra e vortex a mistura por 60 segundos. Alternativamente, para otimizar uma quantidade maior de RNA no rendimento, misture-o com um homogeneizador. Centrifugar a amostra durante 15 minutos a 10 000 x g à temperatura ambiente para separar a fase aquosa e a fase orgânica.
Repita a centrifugação até que a interface esteja compacta. Transfira a fase aquosa superior com cuidado, sem perturbar a fase inferior, para um novo tubo de microcentrífuga de dois mililitros com tampa de dobradiça. Adicione etanol 100% de grau ACS a 1,25 x o volume da fase aquosa adquirida e vórtice por três segundos.
Coloque o cartucho do filtro nos tubos de coleta. Carregue 600 microlitros de cada uma das amostras no cartucho do filtro fornecido no kit de isolamento de microRNA. Centrifugar a 10 000 x g durante 90 segundos para filtrar a mistura através do cartucho.
Em seguida, rejeitar o filtrado. Repita isso até que todo o volume da mistura seja filtrado através da mesma membrana filtrante em aplicações sucessivas. Afinal, a amostra é filtrada.
adicione 700 microlitros de solução de lavagem de microRNA 1 no mesmo cartucho de filtro. Centrifugue por 60 segundos para filtrar a solução de lavagem através do cartucho do filtro. Descarte o filtrado e coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta.
Lave o cartucho do filtro com 700 microlitros de solução de lavagem 2/3 preparada em etanol 100% grau ACS e centrifugue a 10.000 x g por um minuto. Rejeitar o filtrado obtido e colocar o cartucho filtrante no mesmo tubo. Lave o cartucho do filtro com 500 microlitros de solução de lavagem 2/3 e centrifugue a 10.000 x g por um minuto.
Descarte o filtrado obtido e coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta. Lave o cartucho do filtro com 250 microlitros de solução de lavagem 2/3 preparada em etanol 100% grau ACS e centrifugue a 10.000 x g por um minuto. Descarte o filtrado obtido e coloque o cartucho do filtro no mesmo tubo de coleta.
Por fim, transfira o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta e gire o conjunto por cinco minutos para remover o fluido residual. Transfira o cartucho do filtro para um novo tubo de coleta, adicione 50 microlitros de água livre de nuclease ao centro do filtro e tampe o tubo. Incube o tubo em temperatura ambiente por 10 minutos.
Em seguida, gire o tubo por cinco minutos a 8.000 x g para recuperar o RNA em um novo tubo de coleta. Um ensaio de eletroforese de RNA baseado em chip sugere que os isolados de RNA representativos de fezes de camundongos e humanos têm baixa ou falta de composições de rRNA 18S e 28S e o tamanho dos isolados de RNA cai na região do RNA pequeno. Uma outra pequena eletroforese de RNA com a eletroforese baseada em chip revelou que uma grande parte dos RNAs é do tamanho de microRNA.
A pureza do RNA extraído foi alta, conforme indicado pela razão de absorbância de 2,0 para comprimentos de onda de 260 e 280 nanômetros e valor de razão de 1,8 para absorbância em 260 e 230 nanômetros. Para garantir o sucesso da extração orgânica, certifique-se de que as faces sejam óbvias e transfira apenas a fase aquosa superior sem perturbar a fase inferior, mesmo ao custo de um volume reduzido de nossa fase aquosa.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta um método simples para o isolamento de RNA de alta qualidade a partir de amostras fecais, minimizando a contaminação por microrganismos vivos. Foi desenvolvido para uso com sujeitos animais e humanos, garantindo rendimento e pureza otimizados para aplicações posteriores.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Microbiologia
- Biologia Molecular
Antecedentes
- O isolamento de RNA de amostras fecais é fundamental para o estudo de microRNAs.
- Métodos tradicionais podem levar à contaminação por RNA microbiano.
- Um RNA de alta qualidade é essencial para ensaios downstream precisos.
- Este protocolo adapta um kit comercial de isolamento de miRNA para obter resultados aprimorados.
Objetivo do Estudo
- Fornecer um método confiável para extração de RNA de fezes.
- Aprimorar a qualidade e a quantidade de RNA isolado.
- Facilitar pesquisas sobre microRNAs em diversos contextos biológicos.
Métodos Utilizados
- Ressuspenda as amostras fecais em DPBS 1X estéril.
- Utilize um tubo microcentrífugo de dois mililitros para o processamento.
- Adapte um kit comercial de isolamento de miRNA.
- Minimize a contaminação por RNA de microrganismos vivos.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de RNA total de alta qualidade a partir de amostras fecais.
- O protocolo otimizado produz RNA adequado para sequenciamento e RT-PCR.
- Efetividade comprovada na redução da contaminação por RNA microbiano.
- O protocolo é simples e direto para os pesquisadores.
Conclusões
- Este protocolo fornece um método confiável para extração de RNA de amostras fecais.
- O RNA de alta qualidade é crucial para aplicações posteriores.
- Adaptações a kits comerciais podem aumentar o rendimento e a pureza do RNA.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O isolamento de RNA de alta pureza a partir de amostras fecais permite a desvinculação mecanicista na validação de alvos, fornecendo acesso a microRNAs de origem hospedeira sem contaminação microbiana. Isso aumenta a confiança preditiva na descoberta de biomarcadores e na análise de vias metabólicas para doenças gastrointestinais e sistêmicas. A escalabilidade e reprodutibilidade do protocolo facilitam o reuso em larga escala em fluxos de trabalho de descoberta e pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de assinaturas de microRNAs do hospedeiro nas fezes para testes de hipóteses terapêuticas e esclarecimento de vias metabólicas.
- Valor Operacional: Reduz a ambiguidade mecanicista ao minimizar sinais confundidores provenientes de microrganismos vivos durante a preparação da amostra.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Produz isolados de RNA adequados para sequenciamento, RT-PCR e aplicações em microarranjos, permitindo leituras confiáveis em triagens de compostos.
- Valor Operacional: Etapas padronizadas de lavagem e separação de fases garantem reprodutibilidade e escalabilidade para o desenvolvimento de ensaios de alto rendimento.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia o alinhamento translacional de biomarcadores ao gerar perfis de pequenos RNAs relevantes para a doença a partir de modelos fecais animais e humanos.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica, com qualidade e quantidade consistentes de RNA.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a Descoberta Inicial até a Identificação de Fármacos e a Validação Pré-clínica, ao fornecer uma entrada padronizada para ensaios ômicos e funcionais.
- Biologia de Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a redução de riscos biológicos mediante o isolamento de RNA derivado do hospedeiro a partir de matrizes fecais complexas.
- Triagem: Permite a preparação de ensaios por meio de RNA de alto rendimento e pureza, compatível com plataformas analíticas subsequentes.
- Análises: Fornece medidas quantitativas de RNA com alta pureza (A260/A280 ~2,0, A260/A230 ~1,8) para comparação precisa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio de aplicação independente de espécie em modelos murinos e humanos.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma capacidade reutilizável de isolamento de RNA fecal em múltiplos projetos e áreas terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da redução da contaminação microbiana e do aprimoramento da validação do alvo em estudos de hospedeiro-microbioma.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade por meio de etapas otimizadas de ressuspendimento, lavagem e filtração.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes sobre prosseguir ou não, eficiência do capital e redução de riscos biológicos em fases avançadas em programas orientados por biomarcadores.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base em dados confiáveis derivados de RNA.
Considerações de Implementação
- Exige experiência no manuseio de ácidos nucleicos e em técnicas de separação de fases para evitar a ruptura da interface.
- Depende de equipamento de centrifugação capaz de 10.000 x g e de homogeneização a 4.000 rpm para o processamento das amostras.
- Necessita padronização entre equipes quanto aos limites de massa da amostra (25–200 mg) para garantir recuperação consistente da fase aquosa.
- Considerações para adaptação incluem o ajuste dos volumes de lavagem e dos tempos de incubação para diferentes tipos de amostras e cargas de inibidores.
- Limitação prática: amostras superiores a 200 mg podem comprometer a separação de fases e a pureza do RNA devido à instabilidade da interface.
