Visualizando e quantificando danos de DNA específicos do local baseados em endonuclease

Este vídeo de metodologia introduz as etapas cruciais dos protocolos de imunoprecipitação de imunossuagem e cromatina regularmente usados para estudar o processo celular relacionado ao dano de DNA e para visualizar e quantificar o recrutamento de proteínas implicadas na reparação do DNA. Esta técnica fornece ferramentas poderosas para os pesquisadores identificarem novas proteínas ligadas ao lócus genômico danificado, bem como suas modificações pós-translacionais necessárias para a regulação afinada durante a reparação do DNA. Uma vez que essas técnicas podem ser aplicadas para estudar diferentes processos celulares, elas têm potencial relevância se uma microirradição a laser ou o DNA baseado em núcleo danificar sistemas de indução são usados.

Recentemente, várias ferramentas poderosas foram desenvolvidas para induzir danos de DNA específicos do local que podem ser usados para estender nossa compreensão da reparação de DNA. Aplicando abordagens bioquímicas e genéticas, esses utensílios são essenciais para revelar eventos celulares associados ao recrutamento e montagem de complexos de reparação de DNA no local do dano ao DNA. Além disso, essas técnicas permitem o estudo desses processos em resolução de células únicas utilizando células fixas e vivas.

Manter células U2OS em monocamadas em cultura DMEM meio suplementado com soro de bezerro 10% fetal, 2 glutamina milimililar, e a solução antimycótica 1%. Cultivar células em um ambiente umidificado de 5% de dióxido de carbono a 37 graus até que 80% de confluência seja alcançada, renovando o meio a cada dois ou três dias. Aspire o meio e lave as células com PBS.

Desapegar células com solução Trypsin-EDTA. Quando as células se desprendem, pare a atividade da trippsina adicionando mídia cultural às células, gerando uma suspensão celular. Conte as células usando uma câmara de contagem de células.

Placa 20.000 células por mililitro por poço na placa de 24 poços com deslizamentos de cobertura redondas estéreis de 12 milímetros em cada poço. Incubar células por 24 horas a 37 graus em um ambiente umidificado de dióxido de carbono de 5% para permitir a fixação nos deslizamentos de cobertura. Trate as células com 10 nanogramas por neocarzinostatina mililitro ou use o método apropriado para induzir quebras de dois fios através de sistemas baseados em endonucleusa.

Incubar células por uma a oito horas a 37 graus em um ambiente umidificado de 5% de dióxido de carbono para seguir a cinética do reparo do DNA. Fixar células com solução PBS de 4% de formaldeído por 20 minutos a 25 graus. Remova a solução de fixação e lave as células três vezes com PBS por cinco minutos cada.

Retire o PBS e adicione 0,2% Triton X dissolvido em PBS. Incubar as amostras por 20 minutos. Lave as células três vezes com PBS.

Bloqueie a ligação não específica com 5% de BSA diluída no BSA-PBST e incubar as amostras por pelo menos 20 minutos. Adicione a quantidade adequada de anticorpo primário diluído na solução 1%BSA-PBST. Coloque cada deslizamento de cobertura de cabeça para baixo em um parafilme ou 10 gotículas de microliter do anticorpo diluído.

Incubar as amostras em uma câmara de umidade por uma hora e meia a quatro graus. Coloque a tampa deslizando para trás sendo lateral para cima na placa de 24 poços e a lavagem três vezes com PBS. Adicione a quantidade adequada de anticorpos secundários diluídos em 1%BSA-PBST.

Coloque cada deslizamento de cobertura de cabeça para baixo em parafilm sobre uma gotícula de 10 microliter do anticorpo diluído. Incubar as amostras em uma câmara de umidade a quatro graus por uma hora. Coloque os deslizamentos de cobertura para trás sendo configurado na placa de 24 poços e lave três vezes com PBS.

Antes da remoção da última solução de lavagem PBS, retire delicadamente os deslizamentos de cobertura com a metade da pinça e da agulha e, em seguida, coloque-os de cabeça para baixo sobre as lâminas de vidro com gotículas de meio de montagem. A imunoprecipitação de cromatina é uma técnica amplamente utilizada para identificar padrões de ligação de proteínas ao DNA. Para revelar a ocupação de uma proteína de reparação de desejo ao redor do DSB, um anticorpo específico é usado para imunoprecipitar a proteína de interesse da preparação da cromatina juntamente com a região de DNA à qual está ligada.

Além disso, o ChIP tem sido comumente aplicado para mapear a presença de modificações pós-translacionais específicas em uso por DSBs em um determinado lócus genômico. Aproximadamente 20 milhões de células por mililitro devem ser cultivadas em um prato de 15 centímetros para cada amostra. Remova o meio de cultura e lave as células duas vezes com PBS gelado.

Fixar as células com solução 1%formaldeído-PBS. Coloque a placa em um agitador orbital e agitar suavemente por 20 minutos. Pare a fixação com glicina para alcançar uma concentração final de 125 milimilhas e incubar em um agitador orbital com agitação suave por cinco minutos a 25 graus.

Coloque a placa no gelo e lave duas vezes com PBS gelado. Raspe as células em PBS gelado e transfira-as para tubos cônicos de 15 mililitros. Centrifugar as células a 5.000 rpm por cinco minutos a quatro graus.

Aspire cuidadosamente o supernasciente e resuspense a pelota em dois tampão de lise celular mililitro e incubar no gelo por 10 minutos. Centrífuga a 5.000 rpm por cinco minutos a quatro graus. Descarte cuidadosamente o supernascer e resuspenque a pelota em 500 a 1.500 tampão de lise nuclear microliter e incubar no gelo por 30 a 60 minutos.

Transfira o lise para um tubo cônico de poliestireno adequado para a sônicação. Sonicar o lise para cisalhamento do DNA para um tamanho médio de fragmento de 300 a 1000 pares de base. Prepare as dínas para as etapas de pré-limpeza e imunoprecipitação.

Lave as contas duas vezes por 10 minutos a quatro graus com tampão RIPA. Resuspend Dynabeads no mesmo volume de buffer RIPA que você tirou da solução de estoque original nas etapas 3.1. Pré-claro 25 a 30 microgramas de cromatina de cada amostra com quatro dynabeads microliter via rotação por uma a duas horas a quatro graus.

Precipitar as Dynabeads com um ímã e transferir o supernatante para um novo tubo Eppendorf. Adicione a quantidade apropriada de anticorpo a cada amostra de cromatina e gire durante a noite a quatro graus. No dia seguinte, adicione 40 microlitos de Dínamos lavados a cada amostra e incuba-as durante a noite girando a quatro graus.

Lave uma vez com 300 tampão de sal baixo por 10 minutos com rotação a quatro graus. Lave uma vez com 300 tampão de sal de 300 microliter por 10 minutos com rotação a quatro graus. Lave uma vez com 300 tampão de cloreto de lítio de 300 microliter por 10 minutos com rotação a quatro graus.

Lave duas vezes com 300 microliter TE por 10 minutos com rotação para a primeira lavagem a quatro graus e a segunda lavagem a 25 graus. Adicione 200 tampão de eluição de microliter às contas e incuba-as a 65 graus em um termelétrica por 15 minutos com agitação contínua. Transfira o supernatante para um novo tubo e contas elute novamente em 200 tampão de eluição de microliter.

Adicione 500 microgramas por mililitro proteinase-K e meio por cento de SDS e incubar as amostras a 50 graus por duas horas. Realize a extração de clorofórmio e transfira a fase superior aquosa para um novo tubo Eppendorf. Adicione dois volumes e meio de etanol absoluto e 0,1 volume três acetato de sódio molar pH 5.2.

Incubar por pelo menos 20 minutos a menos 80 graus. Retire o etanol e o ar seque a pelota. Resuspend a pelota em 50 microliter TE. Para estudar sua distribuição especial no DNA, deve-se aplicar a imunoprecipitação de cromatina.

Um resultado experimental típico obtido por ChIP-qPCR é apresentado nesta figura, o que demonstra o enriquecimento temporal do gama histona AX como resposta aos danos induzidos pelo I-PpoI no DNA. Na parte esquerda da imagem, o sinal de histona gama detectado oportunamente é mostrado no lado da ruptura, enquanto na parte direita, a distribuição gama histone AX é apresentada na região do gene de controle na qual as quebras demonstradas não foram induzidas. Embora a reparação de DNA seja um campo de pesquisa relativamente recente, nosso conhecimento está aumentando rapidamente com a ajuda de métodos bioquímicos e microscópicos.

No entanto, técnicas bioquímicas, como uma mancha ocidental, imunoprecipitação e espectrometria de massa requerem uma grande quantidade de células. Os processos de reparação do estudo representam um instantâneo da população celular desejada. O campo microscópico tem sido revolucionado por técnicas de alta resolução, como microscópio de super resolução, que permite a visualização de processos celulares induzidos por danos de DNA no nível nucleosômico, além de garantir o mapeamento preciso da co-localização proteica.

Por outro lado, a imunoprecipitação de cromatina é uma ferramenta poderosa, especialmente combinando-a com métodos de sequenciamento para visualizar seu padrão de ligação em todo o genoma de uma proteína relacionada à reparação de DNA desejada e quebras de fios duplos em regiões de cromatina ou heterocromatina.