Formulando e caracterizando um sistema portador de dopamina baseado em exossomo
4 de abril de 2022
Nosso objetivo foi obter uma formulação por carga de dopamina dos exossomos isolados de células-tronco da geleia mesenquimal de Wharton. O isolamento e caracterização dos exossomos, a carga do fármaco nos exossomos resultantes e a atividade citotóxica da formulação desenvolvida são descritos neste protocolo.
Os exossomos podem reagir a vesículas secretadas por uma célula entre 14 e 200 nanômetros de tamanho, e se separar da carga e comunicação intracelular, que chega ao menor subgrupo de vesículas extracelulares. Exossomos que são formados como resultado da diferenciação do endossomo, originam-se da membrana celular. As células-tronco podem ser isoladas de diferentes fontes, como medula óssea ou tecido adiposo.
mas as células-tronco secas do tecido adulto têm maior potencial imunogênico Cons surgindo o tamanho dos exossomos, é dito que fez um papel importante na doença do sistema nervoso central porque pode passar através da barreira hemato-encefálica. Para começar, lave as células-tronco mesenquimais gelatinosas de Wharton com cinco mililitros de PBS. Em seguida, adicionar cinco mililitros de solução de tripsina EDTA antes de colocar o balão numa incubadora.
Após a incubação, coletar as células e centrifugar a 1.500 G por cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e adicione um mililitro de DMEM-F12 contendo 10% FBS ao tubo. Lavar células cultivadas com PBS.
Após a lavagem, adicionar meio DMEM-F12 livre de soro às células e colocá-lo na incubadora. Para isolar os exossomos, coletar o meio livre de soro e centrifugar a 300 G a quatro graus Celsius por 10 minutos. Transfira o sobrenadante para outro tubo e processe-o por centrifugação seriada em velocidades mais altas.
Após a centrifugação final, remova lentamente o sobrenadante e dissolva o pellet em PBS de um mililitro. Misture por vórtice e prossiga com a ultracentrifugação a 110.000 G por 70 minutos a quatro graus Celsius. Adicionar três mililitros de PBS à suspensão do exossomo coletada anteriormente por ultracentrifugação e esterilizar a suspensão diluída por filtração usando um filtro de 0,22 mícron.
Em seguida, transfira 500 microlitros da suspensão esterilizada do exossomo para outro tubo. Em seguida, sequencialmente, adicione 500 microlitros de 0,5 miligramas por mililitro de solução de dopamina e saponina na suspensão esterilizada. Após a incubação ultracentrifugar a suspensão.
A amostra pode ser usada para análise de NTA e DLS para caracterizar exossomos carregados de dopamina ou armazenada a menos 20 graus Celsius até uso posterior. Na análise NTA, o tamanho médio dos exossomos derivados da geleia de Wharton foi determinado como sendo 98 nanômetros e os exossomos carregados com dopamina como sendo 110 nanômetros. Os números de nanopartículas revelados pelas análises de NTA e DLS foram consistentes entre si.
O potencial zeta dos exossomos derivados da geleia de Wharton foi medido como menos 15,7 e os exossomos carregados de dopamina como menos 17,6 milivolts. A análise por HPLC dos exossomos carregados de dopamina detectou o pico de dopamina aos 6,45 minutos. O perfil de liberação cumulativa da droga revelou que 74,8% da dopamina encapsulada foi liberada dos exossomos nas primeiras oito horas.
A citotoxicidade dos exossomos dopamina carregados e livres em fibroblastos foi investigada. Embora os exossomos carregados de dopamina não tenham demonstrado efeitos citotóxicos, a saponina diminuiu a viabilidade dos fibroblastos. O ensaio de MTT mostrou aumento da viabilidade celular quando os fibroblastos foram tratados com os exossomos carregados de dopamina.
A significância estatística dos resultados foi avaliada pela realização de anova one-way. Adicionalmente, os efeitos citotóxicos de diferentes concentrações de exossomos livres foram investigados sobre os fibroblastos. A viabilidade dos fibroblastos foi maior com os exossomos livres na concentração de 25 microlitros por mililitro.
É realmente importante para o sistema nervoso central é o tamanho do paciente, o papel desempenhado nos processos como plasticidade, resposta neuro, comunicação lado a lado, e neurogênese no cérebro. Além disso, graças à superfície dos exossomos, diz, foi observado que eles podem interagir com a droga da célula alvo e a atividade entregue durante a droga é uma conclusão. Pela primeira vez no estudo, desenvolvemos uma nova formulação de droga encapsulando dopamina em exossomos derivados de células-tronco.
Ele propôs que essa formulação será tão promissora para o tratamento da doença de Parkinson.
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Visão Geral
Este estudo concentra-se na formulação de exossomos carregados com dopamina derivados de células-tronco mesenquimais da gelatina de Wharton. O protocolo detalha o isolamento e a caracterização de exossomos, o carregamento do fármaco e a avaliação da atividade citotóxica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Pesquisa com Células-Tronco
- Sistemas de Liberação de Fármacos
Antecedentes
- Os exossomos são pequenas vesículas extracelulares envolvidas na comunicação celular.
- Eles desempenham um papel significativo em diversos processos biológicos, incluindo aqueles no sistema nervoso central.
- As células-tronco mesenquimais da gelatina de Wharton são uma fonte promissora para o isolamento de exossomos.
- Os exossomos podem atravessar a barreira hematoencefálica, tornando-os valiosos para aplicações terapêuticas.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma formulação utilizando exossomos carregados com dopamina.
- Investigar os efeitos citotóxicos da formulação desenvolvida.
- Aprimorar o entendimento sobre sistemas de liberação de fármacos baseados em exossomos.
Métodos Utilizados
- Isolamento de células-tronco mesenquimais da gelatina de Wharton.
- Caracterização de exossomos isolados.
- Carregamento de dopamina em exossomos.
- Avaliação da atividade citotóxica da formulação.
Resultados Principais
- Isolamento e caracterização bem-sucedidos de exossomos.
- Carregamento eficaz de dopamina em exossomos.
- A avaliação dos efeitos citotóxicos demonstrou o potencial da formulação.
- Os resultados apoiam o uso de exossomos em aplicações de entrega de fármacos.
Conclusões
- Os exossomos carregados com dopamina mostram potencial promissor para uso terapêutico.
- O estudo fornece um protocolo para pesquisas sobre entrega de fármacos baseada em exossomos.
- São necessárias mais pesquisas para explorar todo o potencial dessa abordagem.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Os nanocarregadores baseados em exossomos oferecem uma plataforma promissora para a entrega de moléculas pequenas através da barreira hematoencefálica, abordando um desafio crítico no desenvolvimento de fármacos para o SNC. O encapsulamento e a caracterização da dopamina em exossomos derivados de células-tronco demonstram um fluxo de trabalho reprodutível para a avaliação de veículos de entrega de fármacos na fase inicial de descoberta. Essa abordagem reforça a confiança preditiva em portfólios de neurociência translacional ao permitir a avaliação quantitativa da eficácia do carregador e da citotoxicidade.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de mecanismos de entrega mediados por exossomos para terapêuticas direcionadas ao SNC.
- Auxilia na desmistificação biológica mediante a quantificação da eficiência de encapsulação e da cinética de liberação.
- Facilita a validação funcional de sistemas carreadores utilizando ensaios de citotoxicidade e viabilidade.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece protocolos padronizados para isolamento de exossomos, carregamento de fármacos e caracterização de nanopartículas.
- Oferece resultados quantitativos por meio de análises de NTA, DLS, potencial zeta e HPLC.
- Permite avaliação reprodutível de perfis de liberação de fármacos e citotoxicidade in vitro.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para doenças, aproveitando a capacidade dos exossomos de atravessar a barreira hematoencefálica.
- Apóia a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio de dados quantitativos de liberação e viabilidade.
- Reduz a ambiguidade mecanicista nas estratégias de entrega de fármacos para o SNC.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este sistema de transporte baseado em exossomos se insere na transição entre a fase de descoberta inicial e a pré-clínica, permitindo otimização iterativa antes da identificação do composto líder.
- Biologia da Descoberta: Dados quantitativos de encapsulamento e liberação informam testes de hipóteses para entrega no SNC.
- Triagem: Ensaios padronizados de nanopartículas e citotoxicidade apoiam a prontidão e reprodutibilidade dos ensaios.
- Análises: A análise por HPLC e caracterização de partículas fornece métricas comparativas robustas para avaliação de formulações.
- Pesquisa Translacional: A entrega mediada por exossomos favorece o alinhamento de biomarcadores e a relevância em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: O fluxo de trabalho é adaptável para outros fármacos de molécula pequena ou produtos biológicos na pesquisa do SNC.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva em sistemas de entrega direcionados ao SNC.
- Valor Operacional: Padroniza o isolamento, carregamento e caracterização de exossomos para fluxos de trabalho escaláveis.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir em plataformas de carreadores inovadoras.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco de estratégias de entrega ao SNC.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de nanopartículas, caracterização e química analítica.
- Exige acesso a instrumentação de ultracentrifugação, NTA, DLS e HPLC.
- Exige padronização entre equipes dos protocolos de preparação de exossomos e ensaios.
- Adaptável a diversas fontes de células-tronco e cargas de moléculas pequenas.
- A cinética de liberação e a citotoxicidade devem ser validadas para cada nova formulação.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Culturing and Cryopreservation of Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
1:30
Production of Exosomes from Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells
2:20
Dopamine Loading into Exosomes and Characterization of Dopamine Loaded Exosomes
3:15
Results: Development of a Nanocarrier System by Encapsulation of Dopamine into Exosomes Isolated from WJ‐MSCs
5:07
Conclusion
