Controle espaço-temporal da atividade proteica por meio da regulação alostérica optogenética
4 de outubro de 2024
Este protocolo descreve a aplicação de um domínio de interruptor alostérico ativado por luz azul (LightR) projetado para controle espaço-temporal reversível da atividade da proteína. Utilizando Src tirosina quinase como modelo, este estudo oferece um protocolo elaborado para desenvolver e caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Isso demonstra a versatilidade dessa abordagem em todas as classes de enzimas.
Nossa pesquisa geral se concentra no desenvolvimento de métodos optogenéticos que alcançam o controle espaço-temporal preciso da atividade da proteína pela luz. Projetamos domínios reguláveis por luz chamados lightR para regulação alostérica, permitindo-nos estudar como a atividade proteica controlada espaço-temporalmente afeta a sinalização e as funções celulares, auxiliando na modelagem pré-clínica de doenças e no desenvolvimento de terapias. A optogenética enfrenta vários desafios, incluindo alcançar um controle preciso e reversível da atividade da proteína-alvo e imitar com precisão a cinética de sinalização endógena.
As principais questões são prevenir a ativação indesejada, permitir a ativação subcelular direcionada e gerenciar a fototoxicidade para preservar a viabilidade celular. Além disso, o desenvolvimento de ferramentas robustas e universalmente compatíveis é crucial para melhorar a versatilidade e a reprodutibilidade em aplicações. Nosso protocolo para ferramentas lightR de engenharia combina de forma única vários recursos avançados em um único sistema, incluindo regulação alostérica, alta sensibilidade, resolução espacial, controle temporal rígido e especificidade de sinalização precisa.
Essa integração permite a sintonia entre diversas proteínas-alvo, abordando as lacunas em outros métodos que podem não ter uma ou mais dessas capacidades críticas. Estamos interessados em definir os principais processos estruturais e de sinalização que regulam a migração celular. Nosso objetivo é usar nossa tecnologia optogenética para dissecar os regulamentos de migração e interações de células endoteliais.
Entenda como a remodelação da matriz extracelular é mediada pelas células endoteliais e determine como a desregulação desses processos contribui para o desenvolvimento da doença. Para análise bioquímica da placa de quinases lightR uma vez 10 elevado à potência de seis células lin XE para placa de cultura de células de 3,5 centímetros para cada grupo experimental, incube as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 16 a 18 horas. No dia seguinte, transfecte as células com a construção de DNA selecionada usando um reagente de transfecção apropriado.
Cubra o prato com papel alumínio e devolva-o à incubadora. Após 16 a 18 horas de transfecção, coloque um sistema de lâmpada de painel LED de 465 nanômetros dentro da incubadora de cultura de tecidos. Posicione um painel de plexiglass perfurado 10 centímetros acima da lâmpada para obter uma iluminação de três miliwatts por centímetro quadrado.
Use iluminação contínua em células que expressam LightR-Src e D388 R-LightR-Src. Ligue e desligue o painel de LED manualmente para controlar a iluminação. No final dos pontos de tempo experimentais, colher as células sob luz vermelha segura, aspirar o meio e lavar as células com PBS frio.
A iluminação global de células lin XE com LightR-Src projetado por 60 minutos mostra fosforilação de substratos Src, paxilina endógena e células p130Cas expressando o mutante D388 RLightR-Src catalítico inativo não mostra fosforilação de substratos Src na iluminação global. Para começar, coloque duas vezes 10 elevado a cinco células hela por placa de cultura de tecidos de 35 milímetros em meios de cultura de células. Incube as células por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Uma vez que as células tenham se ligado e atingido 60 a 70% de confluência, cotransfecte as células hella com a mistura dada. Cubra o prato com papel alumínio para evitar a iluminação acidental das células. Em seguida, incube as células por 16 a 18 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Em seguida, coloque os vidros cobertos com um diâmetro de 25 milímetros e uma espessura de 0,17 milímetros em uma câmara de placa de seis poços. Cubra três lamínulas redondas de vidro com cinco miligramas por litro de fibronectina em PBS e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Em seguida, enxágue as lamínulas com PBS 16 a 18 horas após a transfecção.
Colete as células hela transfectadas em luz vermelha segura e, em seguida, jogue aproximadamente uma vez 10 elevado a cinco células hela transfectadas em cada lamínula sob luz vermelha segura. Cubra a placa com papel alumínio e incube em meios de cultura de células por duas horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Em seguida, aqueça o meio de imagem preparado e o óleo mineral a 37 graus Celsius.
Em seguida, lave as lamínulas contendo as células com PBS duas vezes. Depois de corar e lavar as células, coloque cuidadosamente a lamínula em uma câmara de imagem de células vivas. Adicione um mililitro de meio de imagem L15 à câmara.
Adicione um mililitro de óleo mineral pré-aquecido ao meio para evitar a evaporação durante a imagem. Mantenha a câmara protegida da luz a 37 graus Celsius até que esteja pronta para a imagem. Coloque a câmara em um microscópio pré-aquecido a 37 graus Celsius.
Selecione uma única célula que expresse a cereja rápida LightR-Src e Src um IRFP. Selecione regiões específicas de interesse dentro da célula para iluminar. Para este estudo, escolha uma pequena área na periferia da célula selecionada.
Crie imagens da célula selecionada a cada minuto durante 20 minutos no estado basal antes da iluminação. Continue a imagem por 50 minutos enquanto ilumina localmente, seguido de 20 minutos após a ativação por um total de 90 minutos. Após a geração de imagens, salve os filmes no formato de arquivo de pilha tif para análise.
A iluminação global das células hela levou à localização do rápido LightR-Src em aderências focais, que foram revertidas assim que a luz azul foi desligada. Essa iluminação também causou um aumento significativo na propagação celular, que parou quando a luz azul foi desligada. O mutante D388 R-LightR-Src catalítico inativo não mostrou disseminação celular.
A iluminação localizada de células hela expressando LightR-Src rápido resultou no acúmulo da construção em aderências focais, levando a saliências de membrana localizadas com iluminação de 50 minutos. Nenhum ganho de área adicional foi observado no escuro de 20 minutos após a iluminação. Fast LightR-Src desapareceu gradualmente das aderências focais na fase escura.
O centróide celular se deslocou em direção à região iluminada. Após ativação rápida do LightR-Src, indicando movimento celular direcionado.
Visão Geral
Este estudo concentra-se no desenvolvimento de uma chave alostérica ativada pela luz azul projetada (LightR) para controle preciso da atividade proteica no espaço e no tempo, utilizando a tirosina quinase Src como modelo. O protocolo permite aos pesquisadores obter controle reversível e regulado por luz sobre funções proteicas, o que facilita a compreensão da dinâmica de sinalização celular.
Componentes Principais do Estudo
Área de Pesquisa
- Optogenética
- Engenharia de proteínas
- Sinalização e migração celulares
Contexto
- Os desafios na optogenética incluem alcançar um controle preciso da atividade proteica e imitar a sinalização endógena.
- Abordar a fototoxicidade e a ativação indesejada é essencial para preservar a viabilidade celular.
- O estudo apresenta uma nova ferramenta chamada LightR que integra alta sensibilidade, resolução espacial e capacidades específicas de sinalização.
Métodos Utilizados
- Engenharia e caracterização do domínio LightR para a quinase Src
- Uso de células HeLa e linhagem XE para experimentos
- Ensaios bioquímicos e técnicas de imagem em tempo real em células vivas
Resultados Principais
- O LightR-Src permite a fosforilação controlada de substratos de Src mediante iluminação com luz azul.
- A iluminação localizada induz alargamento celular e movimento direcionado em células HeLa.
- A ativação e desativação do LightR-Src demonstram reversibilidade e especificidade nas funções celulares.
Conclusões
- Este estudo demonstra um método inovador para o controle optogenético da atividade proteica, fornecendo insights valiosos sobre o comportamento celular.
- Os achados têm implicações para modelos pré-clínicos na pesquisa de doenças e no desenvolvimento terapêutico.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O controle preciso da atividade proteica no tempo e no espaço é um desafio crítico na descoberta inicial e na desmistificação mecanicista para a indústria biofarmacêutica R&D. O sistema optogenético LightR permite a modulação alopática reversível e regulada por luz de proteínas-alvo, possibilitando a investigação com elevada confiança de vias de sinalização e comportamentos celulares. Essa capacidade aumenta a confiança preditiva e a continuidade translacional desde a descoberta até o desenvolvimento de modelos pré-clínicos.
Aplicações Estratégicas em P&D Biofarmacêutico
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a verificação direta de hipóteses terapêuticas por meio do controle temporal da função proteica em células vivas.
- Apoia a desmistificação mecanicista ao isolar os efeitos da ativação ou inativação específica de proteínas.
- Facilita a validação funcional de alvos por meio da modulação reversível LIGADO/DESLIGADO e atividade de fundo mínima.
- Aprimora a confiabilidade preditiva na análise de vias e na priorização de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Fornece sistemas biológicos validados e responsivos à luz para leituras quantitativas em ensaios baseados em células.
- Permite triagem reprodutível e escalonável de compostos que afetam a atividade proteica regulada pela luz.
- Apóia a padronização de ensaios ao minimizar vazamentos e garantir controle temporal rigoroso.
- Permite a reutilização da plataforma em diversas classes enzimáticas e proteínas-alvo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com sistemas relevantes para doenças ao permitir o controle de eventos de sinalização em nível subcelular e tecidual.
- Facilita a continuidade do descobrimento à validação pré-clínica por meio da modelagem de respostas celulares dinâmicas.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco por meio da modulação robusta e reversível de vias de doenças.
- Permite estudos mecanicistas de migração celular e remodelação da matriz extracelular relevantes para a progressão da doença.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O sistema optogenético LightR integra-se à continuidade entre descoberta e pré-clínico ao permitir a modulação orientada por hipóteses da atividade proteica e a análise quantitativa dos efeitos downstream.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação da hipótese nula e a elucidação de vias ao isolar a função proteica com luz.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos e reprodutíveis para avaliação de compostos em ensaios regulados por luz.
- Análises: Oferece leituras de fosforilação e migração celular para análise comparativa entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas e modelos pré-clínicos ao permitir o controle reversível de proteínas relevante para doenças.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular e adaptável para diversas classes de alvos e estudos mecanicistas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade de ensaios optogenéticos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao permitir estudos funcionais robustos.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização e o avanço ajustados ao risco de alvos validados.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em clonagem molecular, optogenética e microscopia em tempo real em células vivas.
- Requer acesso a sistemas de iluminação com luz azul e plataformas de imagem quantitativa.
- Exige padronização entre equipes para garantir entrega reprodutível de luz e análise de dados.
- Adaptável a diversos tipos celulares e classes de enzimas com o desenho apropriado de construtos.
- A fototoxicidade e os efeitos fora do alvo devem ser controlados para preservar a viabilidade celular e a integridade dos dados.
