Um método simples e rápido para isolamento simultâneo de ilhotas primárias e células acinares pancreáticas primárias de camundongos

Este estudo desenvolveu um método simplificado para extrair eficientemente ilhéus primários funcionais e células acinares do pâncreas do camundongo, oferecendo uma ferramenta valiosa para estudar a comunicação intracelular na patogênese do diabetes PPDMA induzido por pancreatite aguda. Os métodos atuais para isolar ilhéus primários de camundongos dependem principalmente da canulação do ducto biliar. Essa técnica requer localização e canulação precisas do ducto biliar, seguidas por perfusão in vivo da solução de colagênase P do parênquima pancreático.

É bastante difícil realizar sem treinamento especializado, alcançar uma perfusão pancreática eficaz e eficiente é um desafio. Este vídeo impede um método simples e rápido para isolar ilhéus de montagem primária, adequado para pesquisadores sem experiência em perfusão. O método também permite a aquisição simultânea de células acinas pancreáticas primárias, gerando quantidade suficiente de ilhéus e células acinares de alta qualidade.

Ele permite que os pesquisadores conduzam experimentos dentro do mesmo contexto patológico e fisiológico, facilitando assim uma análise aprofundada do mecanismo de interação entre ilhéus e células acinares. Isolamento de ilhotas pancreáticas e PACs das células acinares pancreáticas. Adicione a solução salina balanceada de Hank e a solução de colagnase P à placa de 12 poços e adicione três mililitros de solução de colagenase P a um tubo centrífugo de 50 mililitros para digestão subsequente.

Anestesie o camundongo com 1,25% de tribromoetanol antes da cirurgia, seguido de eutanásia. Faça uma incisão abdominal em forma de V para abrir a cavidade abdominal do camundongo. O órgão linfoide vermelho-escuro na região hipocondríaca esquerda é o baço, e o órgão branco ligado ao baço é o pâncreas.

Realize cuidadosamente uma dissecação contundente do pâncreas ao longo da borda inferior do estômago e da junção pancreaticoduodenal. Lave o tecido pancreático isolado na solução salina balanceada de Hank e remova as fixações mesentéricas residuais, o baço e o tecido adiposo peripancreático. Mova o pâncreas pré-processado para uma placa de 12 poços pré-adicionada com dois mililitros de solução de colagnase P.

Segure o pâncreas no lugar com uma pinça usando a mão esquerda e use uma seringa de um mililitro com a mão direita para injetar solução de colagenase P no parênquima pancreático até que o tecido pancreático pareça translúcido e edematoso. Corte o pâncreas em pedaços de tecido de um a dois milímetros em cubos rapidamente com tesoura cirúrgica. Corte a ponta distal a 1,5 centímetro de uma ponta de pipeta de um mililitro para aumentar a abertura, e use essa ponta modificada para transferir os pedaços de tecido pancreático junto com dois mililitros de solução de colagenase P para um tubo centrífugo de 50 mililitros pré-carregado com três mililitros de solução de colagenase P.

Incube o tubo da centrífuga em um banho-maria a 37 graus Celsius por 12 minutos, agitando suavemente o tubo a cada cinco a seis minutos durante esse período. Adicione 10 mililitros de meio completo RPMI 1640 para terminar o efeito digestivo da solução de colagenase P. Pipete o pellet repetidamente com uma pipeta Pasteur de cinco mililitros, de 15 a 20 movimentos para cima e para baixo, até que não restem grandes aglomerados de tecido evidentes.

Adicione 10 mililitros de RPMI 1640 full medium. Depois, centrifuge a 180 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius. E descarte o sobrenadante: Ressuspenda o pellet com 20 mililitros de meio completo RPMI 1640.

Filtre a suspensão por uma peneira de 40 malhas. Depois, centrifuge a 180 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius. Descarte o sobrenadante com cuidado.

Adicione 20 mililitros de solução Ficoll para resuspender o pellet. Depois, adicione lentamente 15 mililitros de RPMI 1640 full medium. Neste ponto, pode-se observar uma interface líquida clara.

Centrifuge suavemente a 640 vezes G por 20 minutos a 25 graus Celsius. Remova cuidadosamente o tubo da centrífuga e aspire a camada superior de médio vermelho usando uma pipeta Pasteur de cinco mililitros. Depois, aspire cuidadosamente as ilhotas contendo líquido na interface da camada líquida e transfira-as para um novo tubo centrífuga de 50 mililitros.

Adicione 20 mililitros de RPMI 1640 full medium. Centrifuge a 180 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Resuspenda o projétil com 20 mililitros de meio completo RPMI 1640.

Centrifuge a 180 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet com 10 mililitros de médio completo RPMI 1640. E transfira para um prato de cultura celular de 60 milímetros.

Sob um microscópio biológico invertido com 100 vezes ampliação, escolha manualmente ilhéus usando uma pipeta de 20 microlitros. Transfira os ilhéus selecionados para uma placa de cultura celular de 24 poços, pré-carregada com 500 microlitros de meio completo RPMI 1640 por poço. Descarte a camada de solução de Ficoll.

Ressuspenda o projétil com 10 mililitros de meio DMEM completo. Filtre por um escorredor de células de 100 micrômetros. Centrifuge a 180 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius.

E descarte o supernadante. Ressuspenda o projétil com 10 mililitros de meio DMEM completo. Centrifuge a 180 vezes G por dois minutos a quatro graus Celsius e descarte o sobrenadante.

Em seguida, resuspenda o pellet com cinco mililitros de meio completo DMEM para experimentos subsequentes. Após a centrifugação por gradiente de densidade de solução de Ficoll, ilhéus foram observados próximos à interface entre a camada líquida transparente e incolor e o meio com pacotes presentes como sedimento no fundo do tubo. Ilhéus eram geralmente ovais redondos, marrom-dourados, com rendimento estável de 120 mais ou menos cinco por camundongo, Figuras A e Figuras B. PACs recém-isolados eram esféricos e agrupados.

As células acinares apresentavam extremidades apicais mais escuras com grânulos de zimógeno visíveis e o rendimento era de 1,6 a 1,95 vezes 10 a sétima célula de potência por camundongo, Figuras C e D. A coloração PI de ilhélots e células acinares de claceína mostra a maioria das células tingidas com calceína verde, viva, e algumas vermelhas PI, mortas, Figura A. Análise quantitativa baseada em J da imagem revela ilhotas isoladas e células acinares com taxas de viabilidade de 97,52 mais ou menos 0,16% e 96,55 mais ou menos 0,95%, respectivamente, Figura B. Células acinares pancreáticas isoladas, atividade basal amilase de 0,79 mais ou menos 0,01 unidades por mililitro. Após estimulação com 10 nanomolares, 20 nanomolares e 50 nanomolares de caeruleina, suas atividades de amilase foram de 1,45 mais ou menos 0,03 unidades por mililitro, 1,65 mais ou menos 0,05 unidades por mililitro, e 1,39 mais ou menos 0,02 unidades por mililitro, respectivamente. A ANOVA unidirecional mostrou que todos os grupos de ceruleína apresentaram atividade de amilase significativamente diferente em comparação com o grupo controle, todos os valores de P menores que 0,001.

Além disso, o grupo dos 20 nanomolares diferia significativamente do grupo dos 10 nanomolares, valor P menor que 0,001, figura A. Ilhotas isoladas com secreção de insulina de 0,27 mais ou menos 0,04 nanogramas por mililitro por ilhéu por hora quando estimuladas com 5,6 milimolares de glicose e 0,94 mais ou menos 0,04 nanogramas por mililitro por ilhéu por hora com 22 milimolares de glicose, GSI é igual a 3,44, Figura B. Este estudo estabeleceu um método para isolamento simultâneo de ilhotas primárias de camundongos e células acinares pancreáticas sem perfusão complexa in vivo. Com uma longa barreira técnica, o método é fácil de operar, resultando em 120 ilhéus mais ou menos 5 e 1,6 a 1,95 vezes 10 à sétima potência das células acinares por camundongo, com ambos os tipos celulares apresentando uma taxa de viabilidade superior a 96%. As ilhotas isoladas exibem secreção normal de insulina estimulada pela glicose e as células acinares são sensíveis à estimulação da ceruleina. Isso confirma que as células obtidas por meio desse método possuem funções intactas, tornando-as adequadas para estudos sobre interações exócrinas pancreáticas e endócrinas.

Embora o método seja limitado pela necessidade de conhecimento básico de anatomia do camundongo, pela exigência de ajustes na dosagem dos reagentes, pelas restrições no número de camundongos processados simultaneamente e pelo risco de aplicação não validada. Ainda assim, ele oferece um protocolo confiável de isolamento celular para pesquisadores sem experiência em perfusão.