Na diferenciação in vitro de rato-tronco embrionárias (MES) células usando o método da gota de suspensão

As células-tronco possuem a notável capacidade de se desenvolver em muitos tipos diferentes de células no organismo. Atuando como um tipo de sistema de reparo para o corpo. Elas podem, teoricamente, se dividir sem limite para repor outras células.

Quando uma célula-tronco se divide, cada célula nova tem a capacidade de permanecer como célula-tronco ou se tornar outro tipo de célula com uma função mais especializada. Essa área promissora da ciência está levando os cientistas a investigar a possibilidade de terapias baseadas em células para tratar doenças in vitro. A diferenciação de células-tronco embrionárias ocorre quando as células são permitidas se agregar em cultura em suspensão.

Na ausência de fibroblastos embrionários de camundongo, camadas de sustentação e fator inibidor de leucemia, esses agregados celulares são chamados de corpos embrionários. O método da gota suspensa é um procedimento eficaz para a diferenciação de células-tronco em corpos embrionários in vitro. Olá, sou Sha Juan da divisão de Medicina Cardiovascular da Universidade de Stanford.

Hoje vamos mostrar um procedimento para diferenciação individual de células-tronco embrionárias em corpos embriónicos utilizando o método de gota suspensa. Normalmente utilizamos este método para diferenciar células-tronco embrionárias em cardiomiócitos. Este procedimento inclui as seguintes etapas: preparação de uma suspensão simples de células-tronco embrionárias, geração de culturas em gota suspensa, transferência das culturas em gota suspensa para placas com aderência ultrabaixa e o plaqueamento de corpos embriónicos em placas revestidas com gelatina.

Ok, vamos começar. O primeiro passo do procedimento é preparar uma suspensão de células isoladas de células-tronco embrionárias. Como cultivamos nossas células-tronco embrionárias indiferenciadas fazendo-as crescer sobre fibroblastos embrionários de camundongo, devemos destacar as células e separá-las dos fibroblastos.

Para fazer isso, realizamos a tripsinização das células utilizando procedimentos padrão. Após a conclusão do tratamento com tripsina, adicione meio de células-tronco embrionárias de camundongo para neutralizar a tripsina. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL.

Em seguida, desagregue as colônias celulares pipetando para cima e para baixo contra o fundo do tubo até obter uma suspensão fina de células sem aglomerados visíveis. Agora, centrifugue as células a mil RPM por cinco minutos. Após a centrifugação, aspire o sobrenadante e ressuspenda as células com 10 mL de meio para células-tronco embrionárias de camundongo.

Transfira a suspensão celular para um frasco T 75 pré-revestido com gelatina a 0,1% e incube a 37 graus com 5% de CO2 por uma hora. Após uma hora, os fibroblastos terão aderido à placa, mas as células-tronco permanecerão no meio. Pipete o meio para cima para coletar as células-tronco.

Centrifugue as células a mil RPM por cinco minutos e aspire o meio. Em seguida, adicione mais 10 mL de meio de diferenciação e re-suspenda as células por pipetagem repetitiva até que pareça haver uma suspensão fina de células. Conte as células utilizando um hemocitômetro.

Agora estamos prontos para cultivar a suspensão celular utilizando o método da gota pendente. Para iniciar o cultivo em gota pendente, use meio de diferenciação para diluir a suspensão de células-tronco até uma concentração de 500 células por 20 microlitros. Em seguida, inverta a tampa de uma placa de cultura de tecidos de 150 milímetros.

Em seguida, pipete 20 microlitros da suspensão celular na superfície interna da tampa da placa. Usando uma pipeta multicanal, adicione 10 mililitros de PBS na placa. Inverta rapidamente a tampa da placa e coloque-a suavemente sobre a placa para formar as gotas suspensas.

Uma vez que a tampa da placa esteja no lugar, transfira cuidadosamente a placa para a cultura em incubadora. As células permanecerão indisturbadas por dois dias. Após a conclusão da incubação, prosseguiremos com a transferência da cultura em gota suspensa para placas de adesão ultra baixa.

Após dois dias, vire cuidadosamente a tampa da placa e, em seguida, aspire 180 microlitros de meio de diferenciação fresco e coloque várias gotas em uma placa de 96 poços com aderência ultrabaixa. Em seguida, recolha as gotas com uma pipeta e transfira-as uma a uma para a placa de 96 poços. Coloque as placas no incubador sem perturbá-las por três dias.

Os corpos embrionários continuarão a crescer em formato esférico. Quando a incubação estiver concluída, estaremos prontos para semear os corpos embrionários, a fim de ajudá-los a continuar a se diferenciar.

Transferimos para uma placa de 48 poços revestidos com gelatina. Para fazer isso, primeiro revestimos cada poço da placa com 300 microlitros de gelatina 0,1%. Após a adição da gelatina, incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, aspire a gelatina da placa de 48 poços. Em seguida, adicione 300 microlitros de meio de diferenciação a cada um. Agora, transfira os corpos embrioides, um a um, da placa de 96 poços para as placas de 48 poços revestidas com gelatina.

Normalmente trocamos o meio no dia seguinte e depois a cada dois dias para manter as células. Utilizamos este método para buscar protocolos melhores para a diferenciação de células-tronco embrionárias. Nos cardiomiócitos, acabamos de mostrar como realizar a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias de camundongo utilizando culturas em gota suspensa.

Este método é eficaz porque o fundo arredondado da gota suspensa permite a agregação de células-tronco embrionárias, proporcionando, assim, um bom ambiente para a formação de corpos embrionários. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que o número de células-tronco embrionárias agregadas em uma gota suspensa pode ser controlado variando-se o número de células na suspensão celular inicial. É isso.

Obrigado por assistir. Boa sorte com seu experimento.