Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores
9 de junho de 2012
Desenvolvemos um novo protocolo para melhorar a eficiência de diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias em neurônios motores. As células-tronco diferenciadas adquirido neurônios motores apresenta como evidenciado pela expressão de marcadores neuronais e neurônio motor utilizando técnicas de imuno-histoquímica.
O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores. Primeiro, cultive células-tronco embrionárias de camundongo em fibroblastos embrionários de camundongo primários e suplemente com fator inibidor de leucemia. Em seguida, potencialize o processo de indução adicionando noggin, FGF-B e FGF-8, induza a especificação de neurônios motores pela incubação com ácido retinóico e agonista de smoothened, seguida por alongamento do axônio e maturação dos neurônios motores.
Por fim, utilize microscopia de imunofluorescência para examinar células MES diferenciadas que expressam forte fluorescência GFP. A geração de grandes quantidades de neurônios motores facilitou a pesquisa em doenças dos neurônios motores em comparação com os protocolos atualmente existentes. Esta abordagem de diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores é mais eficiente. Este método pode fornecer insights sobre a atrofia muscular espinhal.
Ele também pode ser aplicado a outras doenças dos neurônios motores, como a esclerose lateral amiotrófica. Para semear fibroblastos primários de camundongo embrionário, revestir quatro placas de cultura de tecidos de 100 milímetros com oito mililitros de solução de gelatina a 0,1%. Após 30 minutos à temperatura ambiente, descartar o líquido em excesso. Em seguida, diluir um frasco de mitomicina C em PMEF ativado em 40 mililitros de meio PMEF, semear nas quatro placas e cultivar por até uma semana.
Em seguida, descongele um frasco de células MES em banho-maria a 37 graus. Lave as células com cinco mililitros de meio E ES em um tubo de 15 mililitros. Após centrifugar a 800 RPM por cinco minutos.
Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células MES em 20 mililitros de meio ES com fator inibidor de leucemia recém-adicionado. Prossiga removendo 10 mililitros de meio das culturas de PMEF e substitua por 10 mililitros da suspensão de células ES HBG três. Monitore a progressão das células MES ao longo do tempo, desde colônias pequenas em 24 horas até colônias com aproximadamente 100 micrômetros de diâmetro em 72 horas após a semeadura.
Troque o meio diariamente para manter a proliferação das células para a indução de células MES. Diferenciação em neurônios motores. As células-tronco embrionárias de camundongo devem primeiro ser separadas das células alimentadoras PMEF e então cultivadas em ambiente de suspensão no dia da indução.
Para cada cultura de ES de 100 milímetros, prepare um frasco T150 revestido com gelatina a 0,1%. Após 30 minutos à temperatura ambiente, remova a gelatina em excesso e lave três vezes com PBS. Em seguida, aspire cuidadosamente o meio da cultura de ES, certificando-se de não desalojar as colônias fracamente aderidas. Depois, lave uma vez com 10 mililitros de PBS.
Agora, para separar as células MES das PMEF, adicione três mililitros de tripsina-EDTA 0,25% e incube por três a cinco minutos. A 37 graus Celsius, verifique se as células-tronco e as PMEF se desprendeu da placa. Em seguida, adicione 15 mililitros de meio ES fresco e rompa as colônias por pipetagem.
Transfira a suspensão celular para o frasco T150 revestido com gelatina preparado e incube por 30 minutos a 37 graus Celsius para que os PFS adiram à superfície gelatinizada. Agora, colete as células MES flutuantes em um tubo de 50 mililitros e forme um pellet por centrifugação. Re-suspenda as células em 10 mililitros de meio de diferenciação neural.
Conte o meio utilizando um hemocitômetro e, em seguida, plaque em uma placa de cultura de suspensão de 100 milímetros para diferenciação. No dia um, verifique por microscopia se as células MES formaram pequenos agregados flutuantes chamados corpos embrionários. Como pode haver PMEF residual aderido à placa, transfira as células em suspensão e o meio para um tubo de 15 mililitros e, então, centrifugue a 500 RPM por três minutos.
Para colher os corpos embrionários, aspire cuidadosamente o meio e adicione 10 mililitros de meio fresco de diferenciação neural aos EBS em pellet, e então plaque as células em uma nova cultura de placa bacteriológica por 24 horas em diferenciação. No segundo dia, agite suavemente a placa de cultura e transfira o meio e os EBS para um tubo de 15 mililitros. Deixe os EBS sedimentarem por gravidade, então aspire cuidadosamente o meio e ressuspenda os EBS em 10 mililitros de meio de diferenciação de neurônios motores.
Cultivar o meio EBS em um novo recipiente bacteriano por cinco dias para diferenciação. No sétimo dia, verificar se os EBS possuem aproximadamente 150 a 200 micrômetros de diâmetro e expressam sinais fortes de GFP na diferenciação. No quinto dia, dois dias antes de dissociar os EBS, colocar lamínulas redondas de 12 milímetros no fundo de uma placa de 24 poços.
Em seguida, adicione 0,5 mililitros de poli DL-ornitina a 100 microgramas por mililitro e incube a quatro graus Celsius durante a noite. Aspire a poli DL-ornitina e seque as placas e lamínulas ao ar em uma cabine de cultura de tecidos. Enxágue os poços da placa três vezes com água duplamente destilada.
Deixe secar ao ar por um tempo para revestir as lamínulas. Prepare uma diluição fresca de dois microgramas por mililitro de laminina de camundongo em cinco mililitros de PBS 1x gelado. Adicione 0,5 mililitro por poço e incube a quatro graus Celsius durante a noite.
Lave duas vezes com PBS na diferenciação. No sétimo dia, colete os EBS em um tubo de 15 mililitros e deixe os EBS sedimentarem por gravidade. Após quatro lavagens com PBS, adicione um mililitro de ACU max aos EBS, misture suavemente e incube por cinco minutos à temperatura ambiente, em seguida aspire o excesso de ACU max que recobre os EBS.
Agora, adicione três mililitros de meio MND e dissocie os EBS pipetando aproximadamente 20 vezes com uma micropipeta de um mililitro, depois incube por dois minutos à temperatura ambiente e passe a suspensão celular através de uma tampa com filtro para um tubo de 12 por 75 milímetros. Repita esta etapa de dissociação com os agregados e células remanescentes retidos pelo filtro, a fim de enriquecer o rendimento de células isoladas em uma suspensão final de células únicas com volume de seis mililitros. Misture suavemente a suspensão de células únicas e conte as células utilizando um hemocitômetro; dilua as células em meio MND completo até uma densidade de dois vezes 10 à quinta células por mililitro para placa.
0,5 mililitros de suspensão celular por poço das placas de 24 poços preparadas, contendo lamínulas revestidas com poli DL-ornitina e laminina. As células diferenciadas estendem longos neuritos após dois dias. Em cultura, HBG três é uma linhagem de células-tronco embrionárias derivada de um camundongo transgênico que expressa EGFP sob o controle de um promotor específico de neurônios motores, HB nine, com um protocolo de diferenciação definido.
Células MES podem ser usadas para derivar neurônios motores. As células MES indiferenciadas formam colônias arredondadas sobre uma camada de sustentação de fibroblastos. Elas apresentam fraca expressão de GFP.
Essas células MES foram separadas das camadas de alimentação e cultivadas em placas com baixa adesão para formar corpos embrionários. As células MES diferenciadas expressaram forte fluorescência GFP após o sétimo dia. Os EBS diferenciados foram dissociados e semeados em placas revestidas com laminina poli DL ornitina.
As células diferenciadas estendem longos neuritos a partir dos corpos celulares das células cultivadas após dois dias em cultura; os neurônios motores derivados de células MES podem ser caracterizados por coloração de imunofluorescência. Essas células positivas para GFP expressam o marcador pan-neuronal neurofilamento e os dois marcadores específicos de neurônio motor. Eyelid um e colina acetiltransferase; as colorações DPI marcam os núcleos, consideradas em conjunto.
Nosso protocolo de diferenciação em duas etapas fornece um método eficiente para diferenciar células MES em neurônios motores espinais. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender como diferenciar eficientemente células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores. Em conclusão, lembre-se de que a alta qualidade das células-tronco embrionárias de camundongo é o parâmetro mais crítico para gerar eficientemente neurônios motores.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um novo protocolo para a diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores. As células diferenciadas exibem características de neurônios motores, confirmadas pela expressão de marcadores específicos por meio de técnicas imunohistoquímicas.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neurociência
- Biologia de Células-Tronco
- Pesquisa em Neurônios Motores
Antecedentes
- As doenças dos neurônios motores representam desafios significativos na pesquisa.
- Os protocolos atuais de diferenciação são frequentemente ineficientes.
- A melhoria dos métodos de diferenciação pode aprimorar os resultados da pesquisa.
- As células-tronco embrionárias de camundongo são um modelo valioso para o estudo dos neurônios motores.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo mais eficiente para a diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores.
- Facilitar a pesquisa sobre doenças dos neurônios motores.
- Fornecer informações sobre condições como atrofia muscular espinhal.
Métodos Utilizados
- Cultivo de células-tronco embrionárias de camundongo sobre fibroblastos embrionários de camundongo primários.
- Suplementação dos cultivos com fator inibidor de leucemia.
- Adição de noggin, BFGF e FGF8 para induzir a especificação de neurônios motores.
- Uso de ácido retinóico e agonista de smoothened para maturação e alongamento de axônios.
Resultados Principais
- Diferenciação bem-sucedida de células-tronco embrionárias em neurônios motores.
- Expressão de marcadores de neurônios motores confirmada por microscopia de imunofluorescência.
- Geração de grandes quantidades de neurônios motores para fins de pesquisa.
- Eficiência aprimorada em comparação com protocolos existentes.
Conclusões
- O novo protocolo melhora significativamente o processo de diferenciação.
- Este método pode avançar o entendimento das doenças dos neurônios motores.
- Pesquisas futuras podem aproveitar este protocolo para obter insights terapêuticos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias de camundongo em neurônios motores resolve um gargalo crítico na modelagem de doenças e na descoberta precoce de fármacos para distúrbios neurodegenerativos. Este protocolo aumenta a confiança preditiva na geração de tipos celulares relevantes para doenças, apoiando pesquisas translacionais e a validação de alvos para doenças dos neurônios motores, como AME e ELA. A eficiência aprimorada da diferenciação permite a produção escalonável de neurônios motores funcionais, facilitando triagens fenotípicas robustas e a redução de riscos mecanicistas em etapas pré-clínicas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a geração de neurônios motores relevantes para doenças, para interrogatória de alvos orientada por hipóteses.
- Apóia a validação funcional de alvos candidatos em um sistema derivado de células-tronco controlado.
- Melhora a desmistificação mecanicista ao fornecer saídas de diferenciação neural reprodutíveis.
- Facilita a triagem de portfólios ao permitir avaliação precoce de neurotoxicidade e eficácia.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Fornece uma fonte padronizada de neurônios motores para triagem fenotípica de alto conteúdo.
- Permite o desenvolvimento de ensaios quantitativos utilizando leituras de GFP e marcadores imunofluorescentes.
- Apóia a reprodutibilidade e escalabilidade para fluxos de trabalho de avaliação de compostos.
- Prepara sistemas celulares validados para triagem posterior e estudos mecanicistas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha modelos de doenças in vitro com estratégias translacionais de biomarcadores para distúrbios dos neurônios motores.
- Permite continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica utilizando neurônios funcionalmente caracterizados.
- Apoia decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer dados robustos e relevantes para a doença.
- Amplia o valor preditivo para a seleção de candidatos terapêuticos em pipelines de doenças neurodegenerativas.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este protocolo de diferenciação em duas etapas integra-se à fase inicial da transição entre descoberta e pré-clínica, permitindo a geração confiável de neurônios motores para validação de alvos, triagem e pesquisas translacionais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias em modelos de doenças dos neurônios motores.
- Triagem: Fornece neurônios motores prontos para ensaios e validados por marcadores para testes reprodutíveis de compostos.
- Análises: Fornece resultados quantitativos por meio da expressão de GFP e análise de marcadores imunofluorescentes.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a modelos pré-clínicos por meio de sistemas celulares relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma escalável e reutilizável para a geração de neurônios motores em diversos programas de P&D.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na pesquisa de doenças neurodegenerativas.
- Valor Operacional: Padroniza protocolos de diferenciação para garantir reprodutibilidade e escalabilidade entre equipes.
- Valor Estratégico: Permite decisões informadas de prosseguir/não prosseguir e uma gestão eficiente do portfólio em termos de capital.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco e o avanço de candidatos a neuroterapias.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura de células-tronco e protocolos de diferenciação neural.
- Necessita de acesso à infraestrutura de microscopia de fluorescência e imunomarcação para validação de marcadores.
- Exige padronização entre equipes para garantir a reprodutibilidade da eficiência de diferenciação.
- Pode exigir adaptação para diferentes linhagens de células-tronco ou modelos de doenças.
- Depende de populações iniciais de células-tronco de alta qualidade para resultados ótimos.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Culturing Mouse Embryonic Stem Cells (Timing: 3 days)
2:34
Neural Induction (Timing: 2 days)
4:48
Motor Neuron Specification (Timing: 5 days)
5:24
Preparation of Poly-DL-Ornithine/Laminin Coated Coverslips (Timing: 2 days)
6:18
Axon Elongation (Timing: 2 days)
7:47
Results: mES Cell Differentiation into Motor Neurons
9:12
Conclusion
