Paradigmas para Caracterização farmacológica de C. elegans Mutants Transmissão Sináptica

Olá, sou Cody Locke do Laboratório Caldwell do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade do Alabama. Sou Kyle Lee e vou mostrar como preparar vermes para ensaios de exposição ao carb e ao PTZ. Sou Bernard Tu e vou demonstrar como realizar ensaios de out carb.

Sou Kaylin Berry e sou responsável pelos vídeos com C. elegans. Nesta apresentação, narrarei o conteúdo e demonstrarei o ensaio de exposição à PTZ. Hoje, eu e meus colegas mostraremos como caracterizar mutantes de transmissão sináptica utilizando um modelo de epilepsia em C. elegans após exposição à PTZ e ao aldecarbe, com uma série de linhagens mutantes representativas.

Então vamos começar. Kyle Lee nos mostrará hoje a preparação dos ensaios de carboidratos ALD no primeiro dia do procedimento. Certifique-se de que pelo menos 30 vermes em estágio de adulto jovem de cada genótipo e de cada replicata estarão disponíveis para os ensaios de carboidratos ALD no segundo dia.

É preferível que um pesquisador selecione 50 ou mais vermes em estágio L4 em placas NGM frescas, livres de fungicida, semeadas com E. coli OP50 como fonte alimentar. Incube os vermes por 12 a 24 horas em temperatura constante e permissiva. A temperatura ideal é de 20 a 22 graus Celsius, embora 25 graus Celsius seja aceitável.

No segundo dia, prepare uma solução estoque de 100 milimolar de Al Decarb e etanol 70%, espalhando a quantidade apropriada de Al Decarb em placas de NGM. Utilizamos consistentemente 0,5 milimolar de Al Decarb, adicionando 37,5 microlitros da solução de 100 milimolar de Al Decarb em placas de Petri não ventiladas de 60 milímetros contendo 7,5 mililitros de gm. Deixe as placas com Al Decarb secarem por aproximadamente 30 a 60 minutos à temperatura ambiente.

Não é necessário quebrar as tampas depois que as placas estiverem secas. Adicione volumes consistentes de E. coli no centro de cada placa de alde carb e seque por mais 30 a 60 minutos. À temperatura ambiente, normalmente adicionamos 25 microlitros de E. coli OP50.

Este volume de OP 50 cria uma área de alimento suficientemente grande para manter os vermes em uma pequena região no centro da placa, sem superlotação. Assim que a área de alimento secar, prossiga com os ensaios de carb alba. Devido à natureza subjetiva dos ensaios de carb ALD, recomenda-se fortemente que os experimentos sejam realizados de forma cega.

Para fazer isso, um colega do pesquisador principal deve rotular novamente as placas originais contendo os vermes a serem ensaiados, ou o colega pode transferir os vermes das placas originais para placas com código imediatamente antes de iniciar um cronômetro. Agora que as placas foram codificadas, ABO prosseguirá com a análise para começar a contagem do número de vermes paralisados.

Existem duas abordagens principais para definir a paralisia induzida por al decarb agudo. A primeira abordagem define paralisia pela cessação da bombagem faríngea. Nesta nota de vídeo, uma estrutura escura que está situada no lúmen da faringe do verme à direita da tela.

Essa estrutura é chamada de triturador e contrai-se ritmicamente por meio de um mecanismo colinérgico. A locomoção do verme neste vídeo foi grandemente reduzida devido à exposição ao Al Decarb. Ainda assim, o triturador faríngeo desse verme está claramente em movimento.

Portanto, esta minhoca não está paralisada por uma cessação da definição de bombeamento. Deve-se observar neste vídeo que o triturador faríngeo localizado à direita da tela não está contraindo com a cessação do bombeamento, conforme a definição operacional para paralisia induzida por al Decarb. Esta minhoca deve ser classificada como paralisada.

No entanto, assim como o verme no vídeo anterior, este verme está exibindo pequenos movimentos laterais de forrageamento. Apesar de sua locomoção estar prejudicada pelo Al Decarb, esses movimentos impediriam um pesquisador de considerar este verme paralisado segundo a segunda abordagem para definir a paralisia induzida por al Decarb, que é a imobilidade total do corpo e ausência de resposta ao toque. A segunda abordagem para definir a paralisia induzida por al decarb envolve empurrar consistentemente cada verme com um fio de platina e verificar se há resposta.

Se os movimentos corporais não puderem ser detectados a olho nu, nossa abordagem preferida é cutucar nossos vermes duas vezes na cabeça e duas vezes na cauda a cada 30 minutos, durante um total de três horas. Como você poderá observar, o verme neste vídeo não está movendo claramente o corpo. No entanto, como este verme responde ao estímulo movendo visivelmente a cauda, não consideramos esse verme paralisado.

Pela segunda definição de paralisia induzida por al dicarba. Assim como o verme no vídeo anterior, este verme não está movendo claramente o corpo e, portanto, exige um teste de estimulação. No entanto, diferentemente do verme no vídeo anterior, este verme não responde de forma clara à estimulação.

Portanto, este verme é paralisado pela segunda definição de paralisia induzida por al decarb. Embora a diferença entre vermes paralisados e não paralisados por alde carb possa ser sutil, os pesquisadores devem ser capazes de identificar alterações substanciais na transmissão sináptica simplesmente observando um grande número de vermes representativos expostos ao Al Decarb imediatamente após serem transferidos para placas com Al Decarb. Verme selvagem permanece móvel.

Neste vídeo, verá-se os mesmos vermes do tipo selvagem do vídeo anterior após uma hora de exposição à descarbonização com Al. Observe que os vermes estão desacelerando em certo grau, mas ainda estão claramente se movendo.

Diferentemente dos vermes do tipo selvagem, os mutantes tomasin um neste vídeo estão totalmente imobilizados ou mal se movendo após uma hora de exposição. Esse resultado é consistente com os mutantes tomasin um apresentando secreção excessiva de acetilcolina devido à incapacidade de regular negativamente a liberação de neurotransmissores nas junções neuromusculares, a acetilcolina em excesso e as fendas sinápticas nas junções neuromusculares combinadas com a inibição da degradação da acetilcolina. O Bial Decarb torna os mutantes tomasin um hipersensíveis, embora não mostrado aqui, resultados semelhantes têm sido postulados a partir de ensaios com alde carb com alelos de perda de função de on 43, que codifica o ortólogo de C. elegans da proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina dois. Este vídeo mostra mutantes on 25, que são deficientes na transmissão inibitória GABAérgica.

Após uma hora de exposição ao alde carb, semelhante aos mutantes tomasin um e M 43, esses mutantes demonstram prejuízos significativos na locomoção induzidos pelo alde carb e parecem ser mais afetados do que vermes do tipo selvagem expostos ao al Decarb por um período idêntico de tempo. Esse resultado é consistente com os mutantes M 25 apresentando músculos da parede corporal superestimulados devido à combinação da exposição ao al Decarb e à transmissão GABAérgica reduzida, levando a uma maior razão entre transmissão excitatória e inibitória nas junções neuromusculares CL ELs e subsequente paralisia. Contudo, porque os mutantes tomasin um em 43 e em 25 exibem sensibilidades semelhantes ao Al Decarb neste ponto temporal.

Apesar de terem causas diferentes para a superestimulação dos músculos da parede corporal, um experimentador não poderia conhecer o mecanismo subjacente à hipersensibilidade sem antes conhecer as identidades das mutações causadoras. Para este vídeo, retornamos aos mesmos vermes selvagens de um vídeo anterior após três horas de exposição ao al Decarb; neste ponto terminal do nosso ensaio ALD carb, deve-se observar claramente que esses vermes, apesar de serem do tipo selvagem, estão totalmente imobilizados ou mal se movendo. Esses vermes agora são fenotipicamente semelhantes aos mutantes TOM um e M 25 mostrados uma hora após a exposição ao alde carb, presumivelmente porque a transmissão colinérgica excitatória atingiu níveis comparáveis. Em contraste com os vermes do tipo selvagem, os mutantes Synap Bren um permanecem consideravelmente móveis após três horas de exposição ao alde carb.

Esse resultado é consistente com os mutantes Synaptive Bren um, que apresentam níveis normais de secreção de neurotransmissores, possuindo menos estímulo colinérgico em seus músculos da parede corporal do que vermes tipo selvagem após níveis idênticos de exposição ao alde carb neste momento. Mutantes Ponto em quatro, que são especificamente deficientes na transmissão colinérgica, deveriam apresentar sensibilidades semelhantes ao Al Decarb em comparação com os mutantes Synaptive Bren um. Por outro lado, os mutantes hipersensíveis Tomasin um e O 25 permanecem paralisados, não diferentemente dos vermes tipo selvagem.

Vale ressaltar que algumas minhocas, especialmente aquelas resistentes ao Al Decarb, podem tentar sair da placa. Nesse caso, o pesquisador pode espalhar uma quantidade consistente de ácido palmítico, uma barreira física à locomoção das minhocas. Ao redor das placas de Al Decarb, espalhamos 25 microlitros de 10 miligramas de ácido palmítico por mililitro de etanol.

Isso conclui o paradigma de exposição ao Al Decarb. Agora, demonstrarei o paradigma de exposição ao Penta Lean Terazol. Kaylin Berry nos ajudará com os ensaios de PTZ.

A preparação de vermes para ensaios com PTZ é essencialmente a mesma que a preparação de vermes para ensaios com aldecarb. As únicas diferenças significativas entre os dois ensaios são as seguintes. Utilizamos DDH dois O como solvente de PTZ em vez de etanol 70%.

Além disso, como frequentemente inoculamos volumes maiores de PTZ do que de alde carb, deixamos as placas secarem por pelo menos uma hora antes de adicionar OP 50. O ácido palmítico também pode ser usado com PTZ. Além disso, é importante observar que o PTZ é muito menos estável do que o alde carb e deve ser armazenado a menos 20 graus Celsius.

Para iniciar a análise, conte o número de vermes com convulsões induzidas por luz epiléptica a cada 30 minutos, durante um total de uma hora. É preferível classificar o número de vermes com diferentes tipos de convulsões em categorias separadas, como convulsões de corpo inteiro, convulsões anteriores, que chamamos de movimentos bruscos da cabeça, combinação de convulsões anteriores com paralisia dos músculos da parede corporal, que denominamos tônico-clônicas, ou paralisia de corpo inteiro, que chamamos de tônica. A atividade semelhante a convulsões, como observada no verme à direita, geralmente ocorre após convulsões tônico-clônicas, como as observadas no verme à esquerda tônico.

A atividade semelhante a convulsão pode simplesmente resultar de fadiga muscular após convulsões tônico-clônicas repetitivas. No entanto, nossos dados não publicados indicam que alguns vermes podem tornar-se tônicos em PTZ de maneira semelhante à paralisia induzida por al decarb, sem terem sido previamente tônico-clônicos. Aqui mostramos um verme mutante representativo de transmissão sináptica rastejando na ausência de PTZ, um antagonista do receptor GABA e indutor comum de convulsões em vários modelos animais de crises e epilepsia.

Observe que a ponta ou nariz do verme oscila de um lado para o outro durante a forrageira. Neste vídeo, mostramos outro verme da mesma linhagem mutante de transmissão sináptica utilizada no vídeo anterior. Observe que este verme, que está na presença de 2,5 miligramas de PTZ por mililitro de água, continua principalmente a mover a cabeça de um lado para o outro durante a forrageira.

No entanto, esta minhoca interrompe ocasionalmente a forrageamento de um lado para o outro e, em vez disso, empurra repetidamente sua extremidade anterior para frente. Por fim, deve-se observar uma minhoca que possui a mesma mutação das minhocas nos dois vídeos anteriores, na presença de 10 miligramas de PTZ por mililitro de água. Observe que esta minhoca apresenta forrageamento reduzido de um lado para o outro e empurra sua extremidade anterior para frente com maior frequência e intensidade do que com a concentração mais baixa de PTZ.

Esses resultados demonstram a dependência da dose de PTZ, que observamos em todos os mutantes de transmissão sináptica sensíveis ao PTZ. Importante, a exposição ao PTZ não é suficiente para induzir convulsões semelhantes a epilépticas em vermes do tipo selvagem. Da mesma forma, tentamos, mas não observamos, convulsões induzidas por PTZ semelhantes a epilépticas em vermes com déficits específicos na transmissão colinérgica, como em four, ou em vermes com transmissão colinérgica excessiva, como em tomasin one.

Portanto, deveria ser viável caracterizar mais amplamente mutantes de transmissão sináptica com resistência ao alde carb, diferenciando entre déficits na função sináptica geral ou déficits específicos na transmissão colinérgica, com base em suas sensibilidades relativas ao PTZ. Talvez surpreendentemente, um mutante forte de redução de função, ONC 25, que não apresenta expressão detectável de GABA em neurônios motores inibitórios de C. elegans, não exibe convulsões epilépticas espontâneas sob luz, como observado neste vídeo.

Um mutante ONC 25 em 10 miligramas de PTZ por mililitro de água. No entanto, exibe convulsões tônico-clônicas robustas, embora não apresente convulsões anteriores somente com algum movimento precedendo as convulsões tônico-clônicas associadas ao ONC 25 e que imitam as convulsões de mutantes synap Bren um. Portanto, um pesquisador não deve presumir que todos os mutantes inibitórios de GABA apresentarão convulsões tônico-clônicas ou atividade semelhante a crises tônicas estreitamente associadas na presença de PTZ, especialmente considerando a probabilidade de obtenção de alelos mutantes hipomórficos.

Agora que demonstramos a hipersensibilidade ao alde carb e à PTZ por mutantes GABA inibitórios, mas apenas hipersensibilidade ao alde carb e sensibilidade normal à PTZ em mutantes que carecem de regulação negativa da transmissão colinérgica, alguém poderia se perguntar como os mutantes de perda de função de UNC-43 se comportam com a PTZ, já que também são hipersensíveis ao alde carb, assim como nossos outros mutantes de transmissão sináptica. Os mutantes de 43 não exibem convulsões evidentes semelhantes às epilépticas na ausência de PTZ, embora esses mutantes apresentem contrações espontâneas raras e não repetitivas, mas ainda assim generalizadas. No entanto, após exposição a 10 miligramas de PTZ por mililitro de água, os mutantes de perda de função de 43 apresentam convulsões generalizadas robustas, repetitivas e dependentes da dose. Neste momento, esses resultados são ambíguos, mas parecem indicar que o 43 não deve ter um papel específico na transmissão GABAérgica inibitória, ou ter um papel apenas na regulação negativa da liberação de neurotransmissores.

No sistema nervoso de C. elegans, acabamos de mostrar como caracterizar mutantes da transmissão sináptica de CL eglan com estimulantes neurais complementares, alde carb, um inibidor da colinesterase, e PTZ, um antagonista do receptor GABA. Ao seguir um paradigma farmacológico complementar, lembre-se de que o grau de sensibilidade a um estimulante neural não pode prever o grau de sensibilidade ao outro estimulante neural. A utilização de ensaios com alde carb deve ajudar a distinguir mutantes GABA inibitórios, que balançam a cabeça em PTZ, mas são hipersensíveis ao alde carb, de mutantes deficientes na função sináptica geral, que também balançam a cabeça em PTZ, mas são resistentes ao alde carb. Além disso, deve-se considerar que mutantes GABA inibitórios balançam a cabeça em PTZ, enquanto vermes que carecem de regulação negativa da transmissão colinérgica parecem do tipo selvagem em PTZ.

Portanto, o ensaio com PTZ também poderia ser empregado para distinguir entre essas classes de mutantes de transmissão sináptica, que são ambas hipersensíveis ao Alde carb. Em resumo, uma abordagem complementar com os ensaios de PTZ e Alde carb deve permitir que um pesquisador caracterize mutantes de transmissão sináptica em C. elegans de uma maneira impossível com qualquer uma das drogas isoladamente. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.