Evitar osmótica em Caenorhabditis elegans: Função Synaptic de dois genes, Orthologues dos Direitos Humanos NRXN1 E NLGN1, Como candidatos para o autismo

Olá, meu nome é Manuel Ruiz Rubio, do Departamento de Genética da Universidade de Córdoba, na Espanha. Estamos utilizando o *C. elegans* como ferramenta experimental no estudo do autismo, aproveitando o sistema nervoso completamente caracterizado do *C. elegans*. Estamos estudando mutantes do nematodo, afetados em genes envolvidos na sinapse neural e que têm sido associados ao autismo.

Rein Regans são moléculas de adesão da membrana presentes na sinapse. A cabeça de C. elegans contém o amfídio, um órgão sensorial do nematodo que media respostas a diferentes estímulos, incluindo a força osmótica. O amfídio é composto por 12 neurônios sensoriais bipolares com cílios e um axônio terminal pré-sináptico.

Dois desses neurônios, denominados ASHR e ASHL, são particularmente importantes na função sensorial osmótica, detectando repelentes solúveis em água com alta força osmótica. Aqui, apresentamos um método baseado em anel de frutose para medir a evitação osmótica em mutantes com defeitos na sinapse de C. elegans.

Para avaliar as implicações das neuro e neuro na evitação de alta força osmótica, relatamos a resposta diferente de C. elegans mutantes defeituosos nos genes neuro neural, utilizando um método baseado em uma solução de frutose quatro molar. No dia do experimento, prepare uma solução estoque de quatro molar de frutose com 1% de vermelho de Congo e dissolva completamente à temperatura ambiente. Desenhe um anel de um centímetro de diâmetro em uma placa de NGM, traçado logo abaixo do centro do meio sólido.

Usando 15 microlitros da solução vermelha de frutose quatro molar. Deixe a frutose penetrar no ágar por cerca de cinco minutos. O experimento deve ser realizado de forma cega. A placa com cada linhagem a ser S8 deve ser identificada por um segundo pesquisador.

O SA é realizado utilizando essas marcas que são não solicitadas. Quando o experimento tiver terminado, cerca de 24 horas antes da realização da venda, é necessário selecionar L quatro larvas de cada genótipo e transferi-las para uma placa AFL NGM contendo bactérias e coli, mantendo-as a 20 graus Celsius no dia seguinte. O experimento deve ser iniciado com adultos jovens.

Coloque um verme individual de cada linhagem dentro do círculo de repouso e acompanhe cada animal até o momento em que responder à barreira de tic. Devem ser utilizados 10 animais de cada linhagem e um mínimo de três experimentos replicados para se obter um resultado conclusivo. Aqueles que evitarem o anel vermelho seis vezes consecutivas são classificados como normais.

Aqueles que saem do anel em menos de seis tentativas são considerados defeituosos no controle da sensibilidade à osmose; a linhagem de controle deve ser usada em cada SA Bristol, e dois animais são utilizados como controles positivos porque evitam o anel de barreira. As linhagens-controle respondem movendo-se para trás quando encontram uma barreira osmótica composta por frutose quatro molar. Mutantes deficientes em neuro apresentam um comportamento semelhante a esses em relação ao tipo de força.

No entanto, mutantes deficientes em NEUR não conseguiram detectar essa barreira osmótica. As forças dos mutantes duplos car em diferentes alelos neur e nout recuperaram o fenótipo selvagem, respondendo à intensidade osmótica para obtenção de vermes para baixo por alimentação com interferência de RNA, isolando colônias de E. coli da estirpe HD 11 cinco que foi transformada com vetor L 44 40 contendo um fragmento correspondente ao gene alvo. As bactérias são isoladas em placas LBA ou com carbônico no dia seguinte.

Escolha uma colônia de bactérias e inocule o meio líquido LV. Incube por cerca de sete horas com agitação a 37 graus. Coloque uma gota dessa cultura em uma placa de NGM com tampa de carbonato e IPTG e deixe overnight à temperatura ambiente, permitindo que as bactérias cresçam e iniciem a indução da expressão do fragmento do gene alvo.

É necessário usar um controle positivo e um controle não negativo para o experimento de interferência por RNA. Experimentos de alimentação. O controle negativo é igual.

A linhagem I HT 11 cinco transformada com o vetor TL 44 40. Os controles positivos ELI HT 11 cinco células transformadas com o vetor L 44 40 contendo uma sequência do gene 22. A inativação deste gene origina um fenótipo de tremor facilmente distinguível ao microscópio estéril.

Primeiro dia. Quatro larvas de estágio L1 provenientes de placas NGM com bactéria são transferidas para uma placa com bactéria e Kuwait a 20 graus Celsius durante 12 horas. Este é um período de jejum.

No dia seguinte, transfira o adulto jovem rápido para uma placa inoculada com bactérias expressando o gene-alvo específico de interferência por RNA. Incube por cerca de 48 horas a 20 graus Celsius para obtenção da prole F1. Em seguida, selecione alguns adultos F1 bomba e transfira-os para outra placa inoculada com as mesmas bactérias nos dois dias seguintes.

Selecione e isole adultos jovens da prole F2, identificando os fenótipos da linhagem selvagem Bristol N2, gorda, com bactérias ocorrendo empatia. O vetor L4440 estava indo para trás quando fino. A barreira osmótica.

A linhagem tipo verdadeira branca de Bristol alimentada com bactérias expressando um fragmento do gene neur de C. elegans falhou em detectar as soluções osmóticas. No entanto, o mutante deficiente em neur, incapaz de detectar a barreira osmótica, recuperou essa capacidade quando foi alimentado com bactérias expressando um fragmento do gene nlg-1 de C. elegans. Neste vídeo, mostramos um método simples que permite estudar o efeito de genes que afetam a resposta de evitação osmótica em C. elegans.

Um anel de frutose formal apertado com vermelho Congo é usado para analisar a resposta do verme à força osmótica. Mutantes deficientes em neurologina apresentam defeito nesta resposta; no entanto, mutantes NU não têm a detecção de estresse osmótico prejudicada, mostrando uma resposta semelhante à da linhagem selvagem. Este vídeo mostra que linhagens de mutantes duplos portadoras de diferentes alelos nulos em genes de ligação e liberação recuperaram o fenótipo selvagem, respondendo à força osmótica.

Essas observações foram confirmadas utilizando interferência por RNA, com abordagem de alimentação em contenção. Desta forma, a linhagem selvagem apresentou dificuldade em reconhecer a barreira osmótica quando alimentada com bactérias expressando a sequência correspondente do gene ING. Por outro lado, mutantes defeituosos em neur, incapazes de detectar a solução de frutose mais concentrada, recuperaram esse comportamento quando alimentados com bactérias expressando a sequência correspondente do gene NNU.

Os resultados mostrados neste experimento indicam que nrx-1 e nlg-1 podem estar envolvidos na conexão sináptica dos neurônios sensoriais do nematodo e também que interagem entre si de maneira que afeta a função sináptica. Ok, adeus e boa sorte com seus experimentos.