Tornando-Patch pipetas e Eletrodos Sharp com um extrator programável

As pipetas capilares de vidro tornaram-se onipresentes em laboratórios para uma grande variedade de técnicas, como eletroporação em célula única, microinjeção de DNA e eletrofisiologia com eletrodo de patch clamp. Para preparar eletrodos de vidro capilares para gravações com patch clamp, o vidro de silicato é puxado em um puxador programável. As pontas dos eletrodos são revestidas com cera, e então as pontas são polidas com chama e armazenadas para uso futuro. Olá, sou Miriam Goodman do Departamento de Fisiologia Molecular e Celular da Universidade de Stanford.

Neste vídeo, demonstrarei como fabricar pipetas para grampo de membrana e eletrodos afiados para eletrofisiologia. Os microeletrodos de vidro, também chamados de pipetas, são amplamente utilizados na eletrofisiologia há décadas. Atualmente, essas pipetas são produzidas a partir de capilares de vidro utilizando um puxador programável.

Então vamos começar. Para fabricar pipetas para o registro em configuração de patch clamp, utilizamos capilares de vidro borossilicato Sutter limpos e livres de poeira, e empregamos o puxador de microeletrodos com chama Sutter P97. O Pipette Cookbook da Sutter é uma excelente referência para desenvolver programas adequados de puxamento.

Para começar, levante a tampa protetora do puxador. Em seguida, pegue um tubo capilar de vidro da caixa. Certifique-se de recolocar a tampa para minimizar o acúmulo de poeira.

Em seguida, com uma mão, deslize o capilar para o sulco em um dos lados do filamento e aperte levemente o prendedor. Neste momento, o prendedor deve estar suficientemente apertado para impedir que o tubo caia, mas ainda solto o bastante para permitir que seja deslizado para dentro do sulco. Agora, solte o travamento de metal com mola no mesmo lado.

Em seguida, com o polegar e o indicador, segure as abas metálicas que estão presas à parte inferior de ambos os suportes. Solte o outro travamento de metal com mola. Puxe os suportes o máximo possível um em direção ao outro e mantenha-os fixos com uma das mãos.

Em seguida, deslize o tubo através do alojamento do filamento até o entalhe do suporte no outro lado. Evite empurrar o vidro contra o filamento de aquecimento. Aperte as braçadeiras em ambos os lados.

Eles devem ser suficientemente apertados para manter os porta-objetos no lugar, mas não tão apertados a ponto de quebrar o vidro. Agora, feche a tampa contra poeira e pressione o botão verde. Pipetas com ponta afilada para gravações de patch clamp são fabricadas utilizando um programa de puxamento em cinco etapas, com calor e velocidade decrescentes em cada etapa e uma pequena ponta na etapa final.

Este programa utiliza calor e gravidade. O procedimento para fabricar eletrodos finos é muito semelhante, mas, neste caso, usamos o capilar de vidro fino da Warner Instruments, que possui um diâmetro externo de um milímetro e um diâmetro interno de 0,78 milímetros. Também aplicamos um programa de tração que utiliza um motor, além de calor e gravidade, quando os programas de tração são finalizados.

Levante a tampa protetora, solte ambas as braçadeiras e remova a pipeta acabada. Em seguida, coloque as pipetas em uma caixa de trabalho. A caixa pode ser feita colando uma tira de espuma no suporte de uma caixa plástica de ponteiras para pipeta e, depois, cortando de seis a oito fendas na espuma.

Insira as pipetas nas fendas. Quando a caixa estiver cheia de pipetas puxadas, prossiga para a etapa de polimento a fogo para polir as pipetas. Monte um equipamento de micro-fornalha com um filamento de aquecimento de platina controlado por um pedal antes de iniciar o polimento a fogo.

Primeiro, revista a pipeta com cera dental para reduzir a capacitância e melhorar as características de ruído. Para isso, mantenha uma pequena quantidade de cera fundida por perto. Aplique pressão de ar na parte traseira da pipeta para impedir que a cera entre na ponta.

Em seguida, mergulhe brevemente a ponta na cera líquida. E retire agora. Coloque a pipeta no aparelho de polimento e posicione a ponta a aproximadamente 50 micrômetros do filamento.

Leve em consideração que o filamento se expandirá quando aquecido. Aplique um breve pulso de calor de um ou dois segundos para remover a cera da ponta da pipeta e suavizar o vidro. Examine as pontas das pipetas ao microscópio para determinar o diâmetro da abertura e a suavidade.

Para gravações padrão de patch clamp, as aberturas das pontas devem ter de um a três mícrons de diâmetro; descarte pontas ásperas, irregulares ou não uniformes. Coloque a pipeta pronta em uma caixa de trabalho, certificando-se de fechar a tampa para proteger as pipetas contra poeira; repita o procedimento para 10 pipetas bem-sucedidas. Acabei de mostrar como fabricar pipetas para patch clamp e eletrodos afiados utilizando um puxador programável.

O mesmo procedimento pode ser usado para fabricar uma variedade de ferramentas de vidro, incluindo agulhas de injeção para resultados ideais de patch clamp. É importante lembrar de puxar novas pipetas livres de poeira no mesmo dia do experimento e poli-las dentro de uma hora antes do experimento. Verifique também, por inspeção visual, se as pipetas estão lisas e polidas.

Certifique-se de assistir ao nosso outro vídeo, que demonstra como realizar o registro de clamp de patch de canais iônicos expressos em oócitos de opus. Ok, é isso. Agora você é um especialista em pipetas e boa sorte com seus experimentos.