Исследовательская статья

Мультиплексная цитометрия на основе бусинок для функционального профилирования Т-клеток CAR

DOI:

10.3791/70344

⸱

10 июля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Miltenyi Biotec, 2Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 3Außenstelle Zelluläre Immuntherapie, Fraunhofer Institut für Zelltherapie und Immunologie (IZI), 4IRCCS Bambino Gesù Children's Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье представлен мультиплексный анализ проточной цитометрии на основе бусинок для количественной оценки до 12 цитокинов и эффекторных молекул из супернатантов химерных антигенных рецепторов (CAR)-T-клеток, что позволяет быстро и воспроизводимо анализировать инженерную функцию Т-клеток при небольших объёмах образцов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Профилирование Т-клеток CAR представляет собой сложности из-за их гетерогенности, сложных иммунных ответов и ограниченной доступности образцов. Мультиплексные анализы позволяют проводить функциональную оценку, позволяя одновременно обнаруживать широкий спектр эффекторных молекул, включая цитокины, хемокины и цитотоксические медиаторы. Здесь мы описываем мультиплексный анализ на основе бусинок, совместимый с потоковой цитометрией, для анализа секреции эффекторных молекул человеческими химерными антигенными рецепторами (CAR)-T-клетками. Супернатанты CAR Т-клеток инкубируются смесью захватных шариков, включающих несколько популяций, кодируемых флуоресценцией, в сочетании с антителами, специфическими к анализу. Эти шарики связываются с растворимыми мишеньями в образце, образуя комплексы с анализом бусин, которые затем обнаруживаются с помощью маркированных антител обнаружения. Анализ включает панель иммунных медиаторов, таких как интерферон (IFN)-γ, интерлейкин (IL)-2, фактор некроз опухолей (TNF)-α, IL-6, IL-10, гранулоцитно-макрофаговый колонистимулирующий фактор (GM-CSF) и гранзим B. Использование заранее заданных стандартов позволяет количественно измерять несколько анализируемых веществ из одного образца. Сбор и анализ данных могут осуществляться с помощью автоматизированных методов гейтинга, предоставляемых инструментально-ассоциированными или веб-программными инструментами, что облегчает обработку данных. В заключение, представленный мультиплексный анализ позволяет мультипараметрически анализировать функциональность CAR T-ячеек и может применяться в таких контекстах, как исследования, тестирование контроля качества, механистические исследования и функциональная характеристика.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Функциональная характеристика имеет решающее значение в тестировании Т-клеток на химерные антигенные рецепторы (CAR), поскольку даёт представление о силе, безопасности и механизмах действия этих методов. Понимание сигнатур цитокинов и цитотоксических медиаторов помогает оценить терапевтическую эффективность и возможные побочные эффекты, обеспечивая разработку безопасных и эффективных методов лечения. Традиционные моноплексные анализы, такие как ферментно-связанные иммуносорбентные анализы (ELISA), имеют ограничения, такие как требование больших объёмов образцов, длительное время обработки и отдельные запуски для каждого анализа, при этом предлагая ограниченный динамический диапазон внутри отдельныхобразцов 1,2. В отличие от этого, мультиплексные анализы на основе бусины позволяют одновременно обнаруживать несколько растворимых медиаторов, сокращая время обработки и требования к выборке, одновременно увеличивая динамическийдиапазон на 1,2. Эта эффективность и глубина анализа делают мультиплексные анализы ценными инструментами для продвижения исследований и разработок Т-клетокCAR 3,4,5.

Мультиплексный анализ, представленный в этом исследовании, использует захватные шарики, которые демонстрируют определённые флуоресцентные профили в каналах флуоресцеинового изотиоцианата (FITC) и фикоэритрина (PE) и покрыты специфическими антителами против растворимых аналитов. Во время инкубации с образцом эти шарики избирательно связывают целевые анализы из раствора. После захвата анализируемого вещества добавляются антитела к обнаружению для формирования специфических для анализа сэндвич-комплексов. Эти антитела либо напрямую конъюгируются с аллофикоцианином (АПК) (прямое обнаружение), либо с биотином (косвенное обнаружение). Для косвенного обнаружения требуется последующая инкубация с антителом, конъюгированным с APC, (рисунок 1). Полученные комплексы — включающие шарики захвата, аналиты и антитела для обнаружения — анализируются с помощью потоковой цитометрии для количественного определения концентраций анализируемых веществ. Мультиплексный анализ — это технология на основе пластин, включающая заранее заданные стандарты, используемые для генерации специфических для анализа стандартныхкривых 1,2.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Принцип технологии цитокинов и рабочий процесс анализа . Анализ основан на 12 флуоресцентно-кодируемых популяциях капсул захвата, связанных с антителами, специфическими к анализу. При инкубации образца образуются комплексы с анализом бусин, которые можно обнаружить с помощью проточной цитометрии с помощью специфических детективных антител. Рабочий процесс анализа включает 1) подготовку анализируемых стандартов и образцов на фильтрующей пластине, 2) инкубацию с помощью капсул захвата, 3) инкубацию с антиантителами, мечеными биотином, для формирования сэндвич-комплексов, 4) инкубацию с антибиотиновым антителами, маркированными APC, 5) ресуспензию в буфере для измерения и 6) сбор образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Мультиплексный анализ, описанный в этом исследовании, совместим со стандартными потоковыми цитометрами, оснащёнными синей (например, 488 нм; FITC и PE-каналы) и красный лазер (например, 635 нм; канал APC). Поскольку потоковые цитометры широко доступны в исследовательских лабораториях, клинических условиях и средах контроля качества, такая совместимость облегчает внедрение без необходимости дополнительного специализированногооборудования 5. В контексте тестирования функциональности CAR T-ячейки этот подход позволяет мультипараметрически оценивать функциональные отклики в рамках общедоступных аналитических рабочихпроцессов 6. Анализ обеспечивает значительные преимущества для исследований CAR T-клеток, позволяя одновременно количественно оценивать ключевые аналиты, включая GM-CSF, гранзим B, интерферон (IFN)-γ, интерлейкин (IL)-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, моноцитарный хемоаттрактант-белок-1 (MCP-1), перфорин и фактор некроза опухоли (TNF)-α (панель цитотоксичности человека). Эти медиаторы критически важны для понимания активации CAR T-клеток, функции эффектора и выделения цитокинов, связанныхс безопасностью 4,5,7,8.

Рабочий процесс анализа включает опции автоматизированного гейтинга и анализа данных с использованием программного обеспечения, связанного с инструментами, а также независимых от инструментов веб-анализа5. Эти функции поддерживают упрощённую обработку данных профилирования молекул эффекторов CAR T-клеток за счёт снижения объёма ручного вмешательства. Использование автоматизированного анализа может способствовать улучшению согласованности обработки данных и способствовать более эффективной оценке функциональныхпоказаний 8.

Настоящий протокол описывает воспроизводимый, масштабируемый мультиплексный метод профилирования иммунных медиаторов CAR T-клеток. Измеряя 12 различных аналитов в одной выборке, этот подход особенно актуален для механистических исследований, ранних стадий и сопутствующих исследований. На поздних этапах терапии CAR T-клетками может быть полезно сократить количество измеряемых цитокинов, особенно в регулируемой, чувствительной к времени среде контроля качества (QC) для тестирования на выброс лекарств. Для этой цели можно собрать от 1 до 7 цитокинов из представленной панели для разработки индивидуального анализа цитокинов, который можно проверить для инженерной аналитики Т-клеток. Это делает описанный протокол идеально подходящим для различных применений как в исследованиях, так и в условиях контроля качества как на ранних, так и на поздних стадиях терапии Т-клеткамиCAR 3,4,5,9.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все человеческие образцы были собраны у здоровых анонимных добровольцев после получения письменного информированного согласия. Все процедуры были утверждены Этическим комитетом Ärztekammer Nordrhein (#2020272) и выполнялись в соответствии с необходимыми этическими и биобезопасными нормами.

1. Кокультура Т-клеток CAR

  1. Подготовить культуру клеток из модифицированных человеческих CAR Т-клеток при отсутствии и в присутствии родственного антигена, например, опухолевых клеток, представляющих антиген, в соотношении 2,5:1 (эффекторные : целевые клетки).
  2. Определите одну или несколько временных точек для сбора супернатантов для анализа секретируемых цитокинов один раз, или кинетику цитокинов в определённый временной промежуток, например, на 4, 8, 16, 24 и 48 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатанты могут использоваться напрямую или заморозить для последующего использования.

2. Стандартная и образцовая подготовка

  1. Восстановить стандарт анализа, добавив 200 мкл буферной или клеточной культурной среды в гранулу и аккуратно перемешав. Подготовьте шесть реагентных трубок и проведите серию разбавления 1:5 по восстановленному стандарту, до 3,2 пг/мл или 0,6 пг/мл (в зависимости от анализируемого вещества), после чего приготовьте заготовку.
  2. Например, соберите супернатанты с ко-культурой CAR T, например, через 16 или 24 часа после совместной культуры. По желанию можно получить CAR T-клетки для параллельного фенотипирования с помощью потоковой цитометрии.
  3. Центрифугуйте образцы при 10 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Используйте супернатанты аккуратно или разбавляйте их, чтобы соответствовать стандартному диапазону кривых.

3. Рабочий процесс анализа

  1. Закрутите смесь для захвата бусин, чтобы полностью подвесить её. Добавьте 50 мкл стандарта или образца, а также 20 мкл предварительно разбавленных шариков в колодцы фильтрующей пластины на 96 лунок.
  2. Инкубировать 2 часа при комнатной температуре, встряхивая при 450 об/мин, в темноте. Промыйте колодцы дважды буфером 200 мкл с помощью вакуумного коллектора или центрифуги.
  3. Добавьте 100 мкл предварительно разбавлённого реагента 1 1:50 (в буфере). Инкубировать 1 час при комнатной температуре, встряхивая при 450 об/мин, в темноте. Постирайте дважды.
  4. Добавьте 100 мкл предварительно разбавлённого реагента 2 1:50 (в буфере). Инкубировать 30 минут при комнатной температуре, встряхивая при 450 об/мин, в темноте. Помой один раз.
  5. Для получения образцов повторно подвесьте в буфере 200 мкл. Обзор рабочего процесса анализа показан на рисунке 1.

4. Сбор и анализ данных

  1. Собирайте данные с потокового цитометра, оснащённого синими и красными лазерами (требуются каналы PE, FITC и APC). При работе с потоковыми цитометрами MACSQuant используйте шаблоны Express Mode для полностью автоматизированного гейтинга и анализа данных.
  2. В качестве альтернативы загрузите файлы данных FSC или MQD в веб-инструмент InspectoR, который автоматизирует количественное измерение цитокинов и предоставляет готовые к экспорту результаты независимо от используемого инструмента.
  3. Обязательно проверьте правильное разделение 12 различных популяций захвата бусинок в канале FITC и PE.
  4. Применяйте стандартную кривую для расчёта концентрации цитокинов и экспортируйте и визуализуйте результаты.
  5. Для сбора данных на потоковом цитометре MACSQuant используйте 2D-штрихкод флакона с капсулами захвата, который содержит все соответствующие настройки сбора данных.
    1. После входа в программу выберите MACSPlex Filter Plate в качестве шкафчика для образцов и нажмите кнопку штрих-кода на панели инструментов, чтобы активировать 2D-считыватель кода.
    2. Предъявите флакон ридеру, убедившись, что код обращён к мигающему свету на оптимальном расстоянии 0,5–2,5 см.
    3. Во вкладке Autolabel назначите Capture Beads (MPx Cyt T-NK,h) и NoLabel. Для последовательных разбавлений цитотоксического стандарта T/NK ячеек определите позиции групп и во вкладке «Настройки » выберите Express Mode с Type: Analysis и Mode: MACSPlex_Standard, применяя мягкое смешивание по необходимости.
    4. Неизвестные выборки назначаются аналогичным образом: их позиции определены, необязательная группировка и выбор режимов Express Mode, Type: Analysis и Mode: MACSPlex_Sample во вкладке Settings , включая опциональные идентификаторы образцов и описания.
    5. Проверьте правильность определений стоек в таблице экспериментов , убедитесь, что уровень жидкости в скважинах фильтрующих пластин и начинает измерение.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Идентификация репрезентативных популяций захвата бусин, кодирующих 12 растворимых аналитов

Популяции бусинок для захвата были идентифицированы с помощью каналов FITC и PE потокового цитометра. На биаксиальном графике были чётко выделены отдельные скопления шариков, включая IL-10, гранзим B, MCP-1, IL-17A, перфорин, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4 и GM-CSF (рисунок 2). Каждая популяция проявила уникальный флуоресцентный сигнатур, подтверждающий успешное обнаружение мультиплексов и чёткую дифференцировку измеренных цитокинов и эффекторных молекул.

figure-results-1
Рисунок 2: Обнаружение представительных популяций бусинок с захватом мультиплексов . Захватные шарики содержат врождённую флуоресцентную интенсивность, что позволяет различать различные популяции анализируемых веществ. Диаграмма рассеяния показывает разделение сигналов, специфичных для анализа, на основе интенсивности флуоресценции в каналах FITC (B1) и PE (B2). На изображении представлен репрезентативный профиль 12 популяций Capture Beads, кодирующей GM-CSF, гранзим B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), перфорин и TNF-α. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Профиль концентрации цитокинов в CAR T-клетках после совместной культуры с опухолями

После совместной культуры CAR T-клеток с клетками-мишени опухоли концентрации цитокинов были количественно измерены с помощью панели цитотоксичности человека в мультиплексном анализе (см. рисунок 3). Т-клетки CAR выделяли высокие уровни гранзима B (49 950,2 пг/мл), IFN-γ (48 367,8 пг/мл), TNF-α (7 055,2 пг/мл) и GM-CSF (6 653,5 пг/мл), что указывает на мощную активацию и цитотоксичную эффекторную функцию в ответ на воздействие опухоли. Уровни IL-2 превысили верхний предел обнаружения (>10 000 pg/mL), что соответствует сильной пролиферативной сигнализации. Образец не был дополнительно разбавлен и не переизмерялся. В отличие от этого, цитокины, связанные с регуляторными или альтернативными ответами хелперных Т-клеток, включая IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21 и MCP-1, присутствовали на низких или почти необнаруживаемых уровнях. Эти результаты свидетельствуют о том, что Т-клетки CAR сформировали преимущественно иммунный ответ типа 1 (Th1/цитотоксичный), характеризующийся высокой эффекторной активностью и ограниченной выработкой иммуносупрессивных цитокинов.

figure-results-2
Рисунок 3: Репрезентативный цитокинный профиль CAR T-клеток после совместной культуры с опухолями. Инженерные Т-клетки химерного антигенного рецептора (CAR) были совместно культивированы за ночь вместе с опухолями JeKo-1. Клеточные культурные супернатанты собирались после 16 часов инкубации и центрифугировали для удаления частиц. Разбавленные образцы анализировались с помощью панели цитотоксичности человека в мультиплексном анализе. Были проведены две стандартные кривые и определены концентрации всех 12 анализируемых веществ. Представлен репрезентативный выход данных для анализа и расчёта специфических для анализа концентраций с использованием режима Express Mode потокового цитометра. Столбчатая диаграмма и сопроводительная таблица показывают рассчитанные уровни (пикограмма/миллилитр) 12 эффекторных молекул. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Кинетика секреции цитокинов у CAR-Т-клеток при антиген-специфической стимуляции

После совместной культуры CAR T-клеток с целевой экспрессией (антиген⁺) или отсутствием (антиген⁻) родственного антигена, секреция цитокинов отслеживалась со временем с помощью панели цитотоксичности человека в мультиплексном анализе. Т-клетки CAR демонстрировали быстрый и устойчивый выброс цитокинов при распознавании антиген⁺-мишеней, с сильной регуляцией Granzyme B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF и IL-2 в течение 8–24 часа, достигая пиковых уровней к 48 часам (см. рисунок 4). Этот паттерн указывает на мощную активацию и цитотоксичную эффекторную функцию после взаимодействия антигена. Также наблюдались умеренные повышения IL-6, IL-17A и IL-21, тогда как IL-4, IL-10, MCP-1 и Perforin оставались низкими или умеренно повышенными. В отличие от этого, кокультуры с антиген⁻-мишенями показали минимальную индукцию цитокинов во всех аналитах (рисунок 4). Вместе эти данные показывают, что активация CAR T-клеток и производство эффекторных цитокинов происходят именно в ответ на распознавание антигенов и со временем усиливаются.

figure-results-3
Рисунок 4: Кинетика секреции эффекторных молекул CAR-Т-клеток, кокультивируемых с антиген-положительными или антигенотрицательными целями. Инженерные Т-клетки химерных антигенных рецепторов (CAR) были совместно культивированы с целевые клетки, экспрессирующие (Антиген⁺) или отсутствующие (Антиген⁻) родственный антиген CAR T-клеток в течение 4, 8, 16, 24 и 48 часов. В каждый момент времени культурные супернатанты собирались и анализировались с помощью панели цитотоксичности человека мультиплексного анализа для количественной оценки широкой группы растворимых эффекторных аналитов со временем. Кинетика цитокинов для 12 аналитов показана (пикограмма/миллилитр). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мультиплексный анализ использовался для профилирования растворимых иммунных медиаторных ответов в кокультурах CAR T-клеток. Т-клетки CAR, культивируемые совместно с антиген-положительными целями, показали повышенную секрецию IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, гранзима B и IL-2, что соответствует активации эффекторов и цитотоксическойфункции 4,5,8. В отличие от этого, антигенотрицательные контрольные группы демонстрировали низкую выработку цитокинов, что демонстрирует способность анализа различать антигеноспецифические ответы втестируемых условиях 5,8. Эти результаты подтверждают применимость анализа для оценки функциональности Т-клеток CAR, включая использование в анализах, связанных с потенцией, профилировании безопасности, и механистических исследованиях.

Хотя панель с фиксированными 12 анализами даёт широкий обзор иммунной активности CAR T, может быть непрактично охватывать весь спектр анализируемых веществ во всех приложениях. Для целенаправленных рабочих процессов, таких как валидация анализа или тестирование качества (QC) продуктов CAR T-ячейки, панель может быть уменьшена до уменьшенного подмножества (например, IL-2, IFN-γ и TNF-α) для оптимизации анализа при сохранении функциональнойчувствительности 1,2.

Ключевые этапы протокола включают проектирование ко-культуры Т-клеток CAR и правильный выбор условий отбора. В частности, длительность кокультуры и количество эффекторных клеток (коэффициент E:T) напрямую определяют величину цитокина и должны быть определены при установке анализа 5,6. Кроме того, разбавление образца должно быть скорректировано, чтобы концентрации анализируемых веществ попадали в динамический диапазонанализа 1,2. Поэтому устранение неполадок должно быть сосредоточено на проверке производительности стандартной кривой и корректировке условий совместной культуры или коэффициентов разбавления, если сигналы выходят за пределы количественно измеримогодиапазона 1,2.

По сравнению с традиционными одноплексными ELISA, мультиплексная платформа на основе проточной цитометрии генерирует высокоплотные многоанализируемые наборы данных из минимальных объёмов выборок. Позволяя одновременно измерять несколько анализов в одном образце, мультиплексирование может снизить общее потребление реагентов, увеличить пропускную способность образца и сократить время анализа по сравнению с проведением нескольких одиночныханализов 1,2. Автоматизированные варианты получения и стандартизированного анализа могут потенциально снизить зависимость от пользователя вариативности и поддерживать воспроизводимость и масштабируемость в экспериментальных или производственныхусловиях 5,8. Стандартная чувствительность к обнаружению ИФА обычно варьируется от 16 до 2000 пг/мл (может быть ниже для наборов с высокой чувствительностью)7. В рамках платформы, представленной в данном исследовании, самые низкие обнаруживаемые концентрации варьируются от 0,05 пг/мл для самых чувствительных аналитов до примерно 93,8 пг/мл для тех, у кого по своей природе более низкая чувствительность к анализу. Во внутренних оценках более 74% измеренных аналитов показали пределы обнаружения ниже 5 пг/мл, а 38% — ниже 1 пг/мл, что подчёркивает общую чувствительность системы. Поскольку чувствительность мультиплексов может варьироваться в зависимости от цитокина, потенциальная конкуренция между эпитопами остаётся важным фактором. Чтобы минимизировать такие помехи, анализ использует неперекрывающиеся эпитопы для захвата и обнаружения каждого анализа, что снижает смещение, связанное с конкуренцией, и повышает надёжность измерений в условиях мультиплексирования.

Результаты мультиплексного анализа могут различаться в зависимости от чувствительности анализа и биологического контекста, и при определённых условиях концентрации анализируемых веществ могут приближаться к верхнему пределу обнаружения, поэтому их следует оценивать при установке теста. Наоборот, некоторые аналиты (например, MCP-1 и IL-4 в данном исследовании) могут оставаться необнаруживаемыми в зависимости от экспериментальных условий. Кроме того, преданалитические факторы, такие как обработка образцов, могут влиять на измерения цитокинов, поэтому необходимо поддерживать стабильные условия обработки для обеспечения сопоставимости.

В целом этот мультиплексный подход позволяет эффективно и количественно характеризуть функциональность Т-ячеек CAR. По сравнению с большинством существующих мультиплексных платформ для обнаружения цитокинов этот анализ совместим со стандартными потоковыми цитометрами и включает инструментальное программное обеспечение, которое облегчает упрощённый сбор и анализ данных. Хотя обнаружение мультиплексных цитокинов использовалось и в других иммунных условиях, настоящая работа демонстрирует его применение к функциональному профилированию CAR T-клеток в рамках стандартизированного рабочего процесса. Формат на основе шариков позволяет одновременно обнаруживать несколько анализов, поддерживая более высокую пропускную способность по сравнению с методами с одним плексом. Возможные применения включают функциональную оценку препарата, такую как оценка связующих веществ CAR, оптимизация векторов и разработка процессов. Масштабируемость и возможности автоматизированного анализа также поддерживают тестирование потенции, профилирование безопасности и механистические исследования, направленные на понимание поведения и функциональности CART-клеток 5,7,8.

Хотя профили секреции цитокинов дают ценные данные об активации CAR T-клеток и функциональной потенции in vitro, они не могут полностью воспроизвести сложную биологию, определяющую терапевтическую эффективность у пациентов. Такие факторы, как микросреда опухоли, плотность антигена, иммунная регуляция и персистенция in vivo, влияют на работу CAR T-клеток сверх того, что можно измерить контролируемымианализами 6,8,10. Тем не менее, создание надёжных и стандартизированных функциональных анализов, таких как мультиплексное цитокиновое профилирование, является важным шагом к функциональной характеристике лекарственногопрепарата 3,4. Паттерны цитокинов не только указывают на активность CAR T-клеток, но и тесно связаны с токсичными явлениями, включая синдром высвобождения цитокинов (CRS) и иммунно-эффекторный нейротоксичный синдром (ICANS)3,6,7. В настоящее время вариативность методов измерения и отчетности ограничивает сопоставимость между исследованиями, что подчёркивает необходимость стандартизированного, воспроизводимого профилирования иммунныхмедиаторов 1,2,3. По мере развития аналитических технологий и клинических наборов данных конечная цель — определить предсказательные сигнатуры секреции, которые надёжно отражают как терапевтический потенциал, так и безопасность пациентов, преодолевая разрыв между доклиническими тестами потенции и клинической эффективностью.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

М.Л. и М.Х. указаны как изобретатели в патентной заявке WO2021/058811A1. М.Х. указан как изобретатель в патентных заявках и получил патенты, связанные с технологиями CAR T, поданные Центром исследований рака имени Фреда Хатчинсона в Сиэтле, штат Вашингтон, и Университетом Вюрцбурга в Вюрцбурге, Германия. М.Х. является соучредителем и акционером акций T-CURX GmbH, Вюрцбург, Германия. М.Х. получил гонорары от Celgene/BMS, Janssen, Kite/Gilead. Дж.Дж., А.Р. и С.Э. — сотрудники Miltenyi Biotec.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано совместным предприятием Innovative Medicines Initiative 2 по грантовому соглашению No 945393, T2EVOLVE. Это совместное предприятие получает поддержку от программы исследований и инноваций Horizon 2020 Европейского союза, Европейской федерации фармацевтических отраслей и ассоциаций (EFPIA) и Европейской ассоциации гематологии (EHA) (для M.H., C.Q., M.L.), ERA-NET TRANSCAN-3 (совместный звонок ЕС 2021, SmartCAR-T для M.H. и M.L.), Wilhelm-Sander-Stiftung (грант No 2022.134.1 для M.L.), Фонд Паулы и Роджера Райни (для M.H. и M.L.), IZKF Würzburg (S-511, C-543 до M.L.), Немецкий исследовательский фонд (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG, TRR 221 (подпроекты A03 и A06 для M.H. и M.L.); SFB-TRR 338/3 2026–452881907 (подпроекты A02 M.H. и C04 M.L.) и CRC1525 (грант для M.L.), Баварский центр исследований рака (BZKF; TANGO — M.H. и M.L.), INCA AWARD ОТ NOVARTIS (M.L.)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, humanMiltenyi Biotec130-125-800Мультиплексный анализ цитокинов на основе микрочастиц для проточной цитометрии
MACSPlex InspectoR ToolMiltenyi Biotec\Веб-инструмент для автоматизированной регулировки ворот и анализа данных MACSPlex
MACSQuant Analyzer 10 Flow CytometerMiltenyi Biotec130-096-343Прибор для проточной цитометрии множественного измерения данных
MACSQuant Analyzer 16 Flow CytometerMiltenyi Biotec130-109-803Прибор для проточной цитометрии множественного измерения данных
MACSQuant Express ModeMiltenyi Biotec\Программное обеспечение для автоматизированной регулировки ворот и анализа
TexMACS MediumMiltenyi Biotec130-097-196Оптимизированная безсывороточная среда для культивирования и экспансии Т-клеток человека и мыши

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy. Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).
  2. Boulch, M., et al. A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity. Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).
  3. Teachey, D. T., et al. Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).
  4. Liu, C., et al. Cytokines: From clinical significance to quantification. Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).
  5. Leng, S. X., et al. ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).
  6. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).
  7. Wang, X., et al. Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro. Front Immunol. 15, 1254162(2024).
  8. Ren, Y., et al. An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome. Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).
  9. Lock, D., et al. Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells. J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).
  10. Bethke, M., et al. Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer. Cells. 13 (22), 1880(2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

233233B
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи