Анализ экспрессии генов из морских микробных сообществ использованием экологических транскриптомику

Данная процедура начинается с получения биомассы морских микроорганизмов из проб воды путем предварительной фильтрации через фильтры с размером пор 5 и 3 мкм с последующим сбором на фильтр 0,22 мкм. Затем из организмов, задержанных на фильтре 0,22 мкм, экстрагируют общую РНК. рРНК удаляют из общей РНК путем селективной ферментативной деградации и субтрактивной гибридизации; обогащенную мРНК амплифицируют линейно с помощью полиаденилирования и транскрипции in vitro.

Затем амплифицированная антисмысловая РНК преобразуется в двухцепочечную кДНК с использованием случайных гексамеров. Полученную кДНК можно клонировать и секвенировать или подвергнуть прямому пиросеквенированию. Здравствуйте, я Рэйчел Перски из лаборатории доктора Марианны Моран с кафедры морских наук Университета Джорджии.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру анализа экспрессии генов в образцах из окружающей среды с использованием метода экологической метатранскриптомики. Скотт Гиффорд покажет вам, как подготовить образцы окружающей среды для выделения РНК.

Я покажу вам, как выделить РНК из образцов и определить значения RIN. AON продемонстрирует процесс удаления РНК. Затем Мария Коста разберет этапы амплификации РНК и синтеза кДНК.

Итак, приступим. Чтобы начать сбор экологической РНК, мы подготавливаем систему фильтрации, помещая один конец трубки в воду на нужную глубину отбора проб и присоединяя противоположный конец к фильтру с размером пор 3 мкм, разместив насос между двумя концами трубки. Затем фильтр 3 мкм соединяют с системой фильтров 0,22 мкм, а поток из системы 0,22 мкм направляют в мерный стакан.

Пропустите через систему несколько литров воды для промывки. По завершении, не выключая насос, извлеките трубку из воды, чтобы удалить остатки жидкости из линии. Затем с помощью пинцета установите фильтр 0.22 мкм на фильтровальную колонку и закройте ее.

Поместите конец трубки обратно в воду и включите насос. Дождитесь выхода воздуха из обоих фильтров и контролируйте объем профильтрованной воды по мерной шкале на канистре. После фильтрации нужного объема извлеките трубку из воды и удалите остатки воды из системы.

Как только фильтр высохнет, быстро снимите верхнюю фильтровальную пластину и сложите фильтровальную бумагу. Поместите фильтр в контейнер whirl pack и подвергните мгновенной заморозке в жидком азоте. Перед началом эксперимента важно отметить, что поскольку РНК повсеместно распространены, а мРНК быстро деградируют, необходимо соблюдать стандартные меры предосторожности для работы в среде, свободной от рибонуклеаз, включая обработку рабочих поверхностей и пипеток.

Исходя из этого, при работе с любыми материалами, используемыми в данной процедуре, следует использовать чистые перчатки. Кроме того, обработку образцов необходимо проводить в максимально короткие сроки. Чтобы начать экстракцию общей РНК из фильтра 0.22 µm, подготовим пробирки для гомогенизации с шариками, добавив 8 mL буфера RLT с добавлением бета-меркаптоэтанола в коническую пробирку объемом 50 mL.

Затем добавляют от одного до двух миллилитров магнитных частиц для выделения РНК из набора для экстракции из почвы Mobile Power. Быстро извлеките замороженный фильтр из морозильной камеры, не вынимая его из упаковки, и разбейте его молотком.

Поместите измельченный фильтр в подготовленную коническую пробирку объемом 50 мл, герметизируйте крышку пробирки парафином или лабораторной лентой и перемешивайте на вортексе в течение 10 минут. Затем центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 5,000 RPM в течение одной минуты. При комнатной температуре максимально удалите лизат и перенесите его в пробирку объемом 15 мл, после чего повторно центрифугируйте в течение пяти минут.

После центрифугирования при 5 000 ×g супернатант переносят в новую пробирку объемом 50 мл и добавляют к лизату один объем 100% этанола. С помощью шприца объемом 10 мл несколько раз (около пяти) пропустите лизат через иглу калибра 18–21. Для последующих этапов экстракции используйте набор KaiGen R and easy mini в соответствии с инструкциями производителя, нанося лизат на прилагаемую колонку с помощью вакуумного манифольда или путем повторного центрифугирования.

Проведите количественное определение общей РНК спектрофотометрическим методом. После определения выхода общей РНК используйте набор Ambien turbo DNA free в соответствии с инструкциями производителя для удаления контаминации ДНК. Теперь, когда экстракция РНК завершена, я передам общую РНК Йоханне, которая выполнит первый и второй этапы удаления рРНК.

Спасибо, Рэйчел. Для начала удаления рРНК осторожно перемешайте и кратко центрифугируйте 10-кратный реакционный буфер для выделения мРНК перед использованием; в стерильной пробирке объемом 0,5 мл, не содержащей РНК, смешайте соответствующие объемы 10-кратного реакционного буфера, ингибитора РНК, образца тотальной РНК и терминаторной экзонуклеазы. Согласно протоколу Epicentre, инкубируйте реакционную смесь при 30 °C в течение 60 минут в термоциклере с подогреваемой крышкой или на водяной бане.

Затем остановите реакцию путем осаждения с помощью фенола и этанола: сначала добавьте в образец с РНК свободную воду до достижения общего объема 200 µL, а затем добавьте один объем смеси фенол-хлороформ в соотношении 1:1 в пробирку с мРНК и центрифугируйте. Соберите водную фазу, после чего проведите осаждение с помощью 100% этанола и соли. На данном этапе возможна остановка процесса.

РНК можно хранить при температуре -80 °C до момента использования образца в последующих приложениях. После завершения первого этапа обогащения мРНК мы воспользуемся наборами Ambien microbe enrich и microbe express в соответствии с инструкциями производителя, чтобы удалить из образца остаточную рРНК. Для облегчения удаления эукариотической рРНК будет использован набор microbe enrich.

Все объемы определяются в соответствии с инструкциями производителя. Для начала работы дозированно внесите 300 µL буфера для связывания в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте от 5 до 100 µg суммарной РНК в максимальном объеме 30 µL и перемешайте на вортексе.

Осторожно добавьте 2 µL смеси захватывающих олигонуклеотидов, рассчитанной на 5 µg РНК, в буфер для связывания и аккуратно постучите по пробирке. Кратковременно центрифугируйте смесь. Денатурируйте смесь при 70 °C в течение 10 минут, после чего инкубируйте смесь при 37 °C в течение одного часа.

Во время инкубации подготовьте олиго-магнитные бусины, промыв их один раз в воде, свободной от нуклеаз, и один раз в буфере для связывания, фиксируя бусины на магнитном штативе между промывками. Храните бусины на льду, а затем доведите их до комнатной температуры. За пять минут до использования нагрейте промывочный раствор до 37 °C в термоблоке.

Добавьте смесь олигонуклеотидов для захвата РНК к промытым магнитным бусинам с олигонуклеотидами, аккуратно перемешайте содержимое пробирки и центрифугируйте. Кратковременно инкубируйте смесь при 37 °C в течение 15 минут. Поместите пробирку в магнитный сепаратор и подождите около трех минут, после чего аспирируйте супернатант, содержащий мРНК, и перенесите его в пробирку для сбора на льду.

Затем добавьте 100 µL предварительно нагретого промывочного раствора к захваченным бусинам. Осторожно перемешайте бусины на вортексе и сберите супернатант. Перенесите этот супернатант, содержащий mRNA, в пробирку для сбора на льду.

Поместите пробирку для сбора на лед, подготавливаясь к удалению прокариотической рРНК с помощью набора ambi microbe express, который мы будем использовать для удаления остаточной прокариотической рРНК. Используйте биоанализатор или систему Experion для проверки наличия контаминации рРНК и оценки качества мРНК. На данном этапе возможна остановка процесса.

РНК можно хранить при температуре -80 °C. После удаления рРНК мы воспользуемся набором Ambien message AMP two bacteria в соответствии с инструкциями производителя для амплификации мРНК. Теперь, когда мы получили чистый образец мРНК, я передам ход эксперимента Марии, которая подробно расскажет вам о процессе амплификации мРНК и синтеза кДНК.

Спасибо, Ханна. Прежде чем приступить к амплификации мРНК, рассчитайте объемы каждого компонента мастер-миксов набора Ambien message AMP two bacteria онлайн; затем мы начнем полиаденилирование матрицы РНК, поместив до 1000 ng общей РНК в стерильную микроцентрифужную пробирку, не содержащую РНКаз. Используйте 6.5 µL образца и не добавляйте воду, не содержащую РНК, в первый буфер для синтеза РНК посредством инвитро-транскрипции.

Рекомендуется использовать гибридизационный oven или инкубатор для обеспечения равномерного распределения температуры. Поскольку крайне важно избежать образования конденсата внутри пробирок, мы настоятельно рекомендуем проводить инкубацию реакции транскрипции in vitro в течение 14 часов. Чтобы максимально увеличить выход RNA, проводите IBT в конечном объеме реакции 40 µL; храните A RNA при температуре -80 °C в аликвотах объемом примерно 10 µL.

После амплификации РНК наступает этап синтеза комплементарной ДНК (кДНК). Для синтеза кДНК из РНК используется набор Promega universal ribot Clone CDNA synthesis system. В инструкции к набору приведено руководство по конверсии 2 мкг РНК в кДНК. Мы рекомендуем использовать от 6 до 10 мкг РНК, соответственно масштабируя объемы реакций.

Очистите кДНК с помощью осаждения этанолом или системы очистки ДНК Promega Wizard. Образцы следует хранить при температуре -80 °C в соответствии с инструкциями производителя. На данном этапе двухцепочечную кДНК можно подвергнуть прямому секвенированию. Из 10 литров морской воды мы экстрагировали примерно 10 мкг экологической РНК и амплифицировали ее в 20 раз; путем конверсии амплифицированной мРНК в двухцепочечную кДНК были получены количества материала, достаточные для секвенирования и анализа экологических транскриптов. Мы только что продемонстрировали вам способ оценки экспрессии генов в морских микробных сообществах с помощью экологической метатранскриптомики.

Помните, что при выполнении данной процедуры мРНК быстро деградирует, а РНКа присутствуют повсюду. Поэтому соблюдайте стандартные меры предосторожности для работы в условиях отсутствия РНКаз и обрабатывайте образцы максимально быстро. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.