Бактериальный анализ экспрессии генов Использование Microarrays

Здравствуйте, меня зовут Эна. В нашей лаборатории мы регулярно проводим профилирование экспрессии генов. Мы используем этот метод для мониторинга дифференциально регулируемых генов при сравнении мутантного типа и дикого типа. Сегодня у меня есть образцы РНК дикого типа и мутантного типа, и сначала мы проведем обратную транскрипцию.

Мы используем методы непрямого мечения; преимуществом данной методики является предотвращение систематической ошибки оператора («eye bias»), которая может возникнуть при прямом мечении. Для этого мы берем образцы РНК, добиваясь получения 3 µg РНК в общем объеме 13 µL. Затем мы добавляем 2.5 µg случайных гексамеров в наши пробы.

Затем образец инкубируют при 75 °C в течение восьми минут для денатурации РНК. После этого добавляют коктейль для обратной транскрипции, который содержит смесь AM L-D-L-D-U-T-P, буфер для обратной транскриптазы, а также ET TT. Смесь перемешивают и инкубируют образец при 42 °C в течение четырех часов. По истечении четырех часов образцы извлекают.

Теперь в пробирке находится смесь кДНК и РНК. Нам необходимо провести гидролиз РНК, добавив гидроксид натрия и ЭДТА; конечная концентрация гидроксида натрия должна составлять 100 мМ, а конечная концентрация ЭДТА — 5 мМ.

Теперь мы инкубируем образцы на водяной бане при 65 °C в течение 10 минут. Инкубация завершена, и теперь мы подготовим образцы, добавив HEPES с pH 7 до конечной концентрации 500 мМ. На данном этапе образцы можно хранить при -20 °C или приступить к очистке.

Для очистки кДНК мы используем набор для очистки ПЦР-продуктов KaiGen. Однако, поскольку буфер Bush и ионный буфер содержат фторид, мы готовим собственные фосфатный буфер Bush и фосфатный ионный буфер; к ним добавляют 300 µL PPI и медленно дозируют в пробирки. Затем смесь переносят в колонки и центрифугируют в течение одной минуты на максимальной скорости. Далее используют приготовленный нами фосфатный промывочный буфер: добавляют 750 µL, а затем повторяют процедуру еще раз.

Мы снова центрифугируем образцы, чтобы убедиться, что весь осадок сформировался. Затем мы перенесем содержимое этих пробирок в пустые пробирки типа Эппендорф. Я добавлю 30 мкл фосфатного буфера PE, который представляет собой 40 мМ раствор фосфата калия при pH 8.5.

Теперь вам просто нужно убедиться, что вы добавляете всё в центр колонки, и инкубировать при комнатной температуре в течение одной минуты. Таким образом, центрифугирование продлится еще одну минуту, после чего я добавлю еще 30 µL буфера и проведу инкубацию при комнатной температуре. Затем я извлеку колонку; общим объемом CDA будет 60 µL.

После очистки кДНК ее можно хранить при температуре -20 °C; также ее можно высушить и хранить в таком виде, поэтому мы высушили кДНК в лиофилизаторе. Теперь в пробирке у нас находится сухая кДНК, которая была модифицирована. Далее я пересуспендирую сухой образец в.

Я ресуспендирую образец в 10 мкл 15 мМ бикарбоната при pH 9. Я сделаю это путем перемешивания вверх-вниз; на этом этапе очень важно хорошо ресуспендировать кДНК. Для того чтобы реакция гибридизации прошла успешно, эта реакция должна проводиться в темной комнате, так как флуоресцентные метки чувствительны к свету.

Однако, поскольку эти реагенты из области наук о жизни поставляются в индивидуальных упаковках, S5 имеет фиолетовую крышку, а S3 — оранжевую; кроме того, при суспендировании S5 выглядит синим, а Cary — пурпурным. Поэтому в темной комнате я перенесу эти образцы в пробирки с красителем, повторно суспендирую краситель и перенесу их обратно в имеющуюся у меня пробирку.

Затем я проведу инкубацию в темноте в течение двух часов. По истечении двух часов инкубации реакцию остановят путем добавления 35 µL 100 мМ ацетата натрия при pH 5.2. После этого мы проведем очистку с помощью аналогичной процедуры очистки. Однако в этот раз мы будем использовать буфер для промывки и буфер для элюции, предоставленные компанией Qiagen.

Вы можете описать места, в которые помещается образец, и это должно очистить прибор. Таким образом, вы можете подготовить ваш образец или смесь прямо сейчас. Вот мой образец, меченный scifi; здесь мы видим OD 260, что показывает содержание CDA, и OD 650, что показывает включение D для scifi. А здесь мой образец, меченный side three.

Снова возьмите шесть концентраций и пять измерений по 50 на участке три для включения. Поскольку моя корпорация D работает эффективно, я объединю образцы. Теперь осторожно перемешайте их. И теперь мы снова подготовим образец, используя обратную связь.

Итак, для подготовки предметного стекла мы проведем регидратацию, поместив стекло на поверхность воды, что позволит увеличить размер пятен. Затем, чтобы закрепить результат, мы высушим их при температуре 100 °C, после чего проведем УФ-гибридизацию или УФ-сшивку пятен с поверхностью стекла. Затем мы инкубируем стекло в подготовленном буфере для предварительной гибридизации. Я кладу стекло рабочей стороной вниз, но так, чтобы оно пока не касалось воды.

И в таком виде мы подождем пять минут. Итак, этот бокс выглядит больше, они должны стать более блестящими, чем до нанесения, и вы просто высушите образец, поместив предметное стекло при 100 °C, и проследите за конденсацией. Затем мы проведем сшивку с помощью youi.

Для гидратации я просто погружу предметное стекло в предварительно подогретую воду. Этот процесс должен быть очень быстрым, так как цель здесь — удалить все несвязанные олигонуклеотиды с пятен. Если выполнять этот этап слишком медленно, на пятнах появятся «хвосты комет».

Следите за тем, чтобы выполнять эти действия быстро, и не вынимайте предметное стекло из воды; выполняйте эту процедуру в течение 30 секунд. Затем немедленно центрифугируйте при комнатной температуре в течение пяти минут при 700 rpm. Теперь поместите предметное стекло в заранее подготовленный буфер для гибридизации; медленно погрузите стекло в контейнер и инкубируйте при 42 °C не менее 45 минут. Перед нами высушенный образец, предназначенный для гибридизации. Сначала мы ресуспендируем его в воде.

На этом этапе мы просто ресуспендируем образец, перемещая его вверх и вниз, стараясь не подвергать образец чрезмерному воздействию света. Затем добавьте 1,5 мкл ДНК спермы с концентрацией 10 mg/mL. После этого добавьте 1,2 мкМ тРНК.

Концентрация составляет 12,5 мг, мы добавляем тРНК и некоторое количество ДНК сперматозоидов для блокирования неспецифического связывания. Затем мы добавляем 5,35 мкл 0,3X SSC, что обеспечивает конечную концентрацию 3X. И, наконец, мы добавляем 3,5 µL 1% SDS.

Теперь мы будем кипятить смесь в течение пяти минут, затем центрифугируем на максимальной скорости в течение пяти минут, после чего образец будет готов. Прошел час с момента инкубации нашего препарата, и сейчас у меня есть вода и изопропанол. Сначала я буду промывать препарат в воде, чтобы удалить SDS, затем промою его изопропанолом и сразу перенесу в стандартную измерительную кювету.

При этом будьте осторожны и не допускайте длительного контакта препарата с воздухом, чтобы предотвратить высыхание. Поэтому я переношу образец непосредственно из буфера Harm Station в воду и промываю предметное стекло. Промывайте в течение пары минут, следя за тем, чтобы движение было только вертикальным, без боковых смещений.

Также убедитесь, что предметное стекло не находится в воде, и немедленно перенесите его в изопропанол. Оставьте его там еще на несколько минут. Затем, пожалуйста, выдержите предметное стекло при комнатной температуре в течение пяти минут.

700 R.Cool. Таким образом, наш предметный стеклo также готово к гибридизации; его рекомендуется хранить в контейнере для предметных стекол, чтобы защитить его от пыли. Для этапа сбора мы будем использовать лифт или слип.

На покровном стекле есть белые полоски, которые создают определенный зазор и обеспечивают пространство для размещения образца между покровным стеклом и предметным стеклом. Я очищаю его этанолом, затем аккуратно укладываю, чтобы убедиться в отсутствии посторонних частиц. Сначала мы возьмем шаблонный предметный слайд с отмеченной областью печати и поместим сверху подготовленный слайд, убедившись, что они идеально совмещены.

Убедитесь, что они идеально выровнены. Также необходимо проверить, чтобы полоски находились с той стороны, которую мы будем обращать вниз. Это трудно заметить, но обязательно убедитесь, что вы их видите.

Полоски должны находиться по бокам предметных стекол. Образец мы будем наносить с боков. Я беру небольшое количество образца — сначала 15 µL — и начинаю нанесение от угла покровного стекла.

Затем я медленно затягиваю его, перемещаясь вдоль края, чтобы покрыть всю поверхность. На этом этапе очень важно не допустить появления пузырьков воздуха; я беру еще 15 мкл мигратора и наношу его на края предметных стекол, чтобы предотвратить высыхание. Таким образом, наш образец готов; теперь следует инкубировать предметные стекла в гибридизационных камерах, которые имеют микроканалы для увлажнения стекла в процессе гибридизации.

Затем мы нанесем по 10 мкл 3X SSC в шесть углов предметного стекла. Всего в камере предусмотрено шесть мест: по одному в каждом углу и по одному с каждой стороны. Убедитесь, что вы переносите предметное стекло очень аккуратно, чтобы покровное стекло не сдвинулось. Когда вы положите предметное стекло лицевой стороной вверх, оно прилипнет к нанесенной воде, и вы сможете установить покровное стекло. Убедитесь, что винты плотно затянуты.

Мы будем инкубировать камеру для конверсии в водяном термостате при 65 °C, но не следует помещать ее непосредственно на дно. Поэтому мы используем пластиковый барьер, чтобы предотвратить избыточную передачу тепла. Мы осторожно устанавливаем камеру для ионизации, и чтобы избежать ее смещения, можно добавить какой-либо груз.

Инкубация будет продолжаться в течение ночи, обычно от 10 до 12 часов. Для промывки срезов используется 1X SSC с 0,05% SDS. Этот этап необходим для удаления покровного стекла.

Это будет первая стадия промывки. Затем мы проведем еще две стадии промывки только в 0,06% six XSC с использованием всего имеющегося SDS. После этого мы завершаем процедуру, берем предметные стекла и помещаем их срезом вниз в контейнер.

Затем мы осторожно покачаем образец из стороны в сторону, и покровное стекло аккуратно отслоится. Теперь мы перенесем образец в другой промывочный буфер, содержащий XES. Подождите одну минуту.

Перейдите к этапу 06 XSSC. Чтобы убедиться, что мы полностью удалили FDS, повторим процедуру еще раз. Центрифугируйте для осушения при комнатной температуре в течение пяти минут при 700 RP. Храните этот предметное стекло в коробке для стекол, так как оно чувствительно к свету.

Перед вами сканер предметных стекол. Поместите стекло сюда, в это небольшое пространство, обратной стороной вниз, меткой в указанном направлении. Для второго стекла просто определите область, которую необходимо отсканировать. Выделите эту область на наших стеклах. Мы использовали 16 пинов для печати наших образцов на стеклах.

Таким образом, каждый блок соответствует одному пину, и наши предметные стекла содержат более 8 000 пятен. Мы представляем геном вируса в двух экземплярах, так как он содержит около 4 000 генов. Таким образом, на каждый используемый нами олигонуклеотид приходится по два пятна.

При увеличении в данном конкретном эксперименте можно увидеть, что мы сравниваем мутантов регулятора транскрипции с диким типом; мутанты помечены scifi, что дает красный цвет, а дикий тип — site 3, что дает зеленый цвет. Таким образом, любые области, которые кажутся красными, например эти пятна, указывают на то, что содержание транскриптов у мутанта было выше, чем у дикого типа.

Таким образом, они выглядят красными или имеют красные оттенки, и любой участок, который выглядит зеленым, указывает на то, что содержание транскрипта было выше у дикого типа по сравнению с мутантом. А любое пятно желтого цвета указывает на то, что данный транскрипт присутствовал в равном количестве как у мутанта, так и у дикого типа. Таким образом, при наложении они выглядят желтыми, как эти точки.