Электрофизиологические методы регистрации синаптические потенциалы от NMJ личинок дрозофилы

Для получения стабильных электрофизиологических записей с нервно-мышечных соединений личинок Joof. Сначала вскройте личинку, чтобы обнажить стенку тела, мышцы и нервную систему перед началом записи. Аксоны у основания ЦНС перерезают позади вентрального ганглия.

Затем регистрирующий электрод помещают на исследуемую мышцу, а стимулирующий электрод — рядом с иннервирующими мотонейронами. Перерезанные аксоны мотонейронов втягивают в стимулирующую пипетку. После этого можно регистрировать возбуждающие синаптические потенциалы.

Здравствуйте, я Венди MLA из лаборатории Маккейба кафедры физиологии и клеточной биофизики Колумбийского университета. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру измерения синаптической передачи в нервно-мышечном соединении личинок GE. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения физиологии синапсов и нейротрансмиссии.

Итак, приступим. Для начала эксперимента проведите диссекцию блуждающих личинок третьей стадии и звездчатых личинок, чтобы обнажить стенку тела. Данный протокол модифицирован для электрофизиологических экспериментов путем использования коротких диссекционных булавок.

Их длина составляет примерно от двух до четырех миллиметров, поэтому вероятность их соприкосновения с объективом микроскопа или электродами во время эксперимента ниже. После обнажения брюшной стенки с помощью пинцета зафиксируйте ЦНС и слегка приподнимите ее. Затем перережьте моторные аксоны периферических нервов и удалите мозг.

После извлечения мозга дважды промойте препарированный образец буфером HL 3.1 с 1 mM кальция. По завершении препарирования можно приступать к внутриклеточной регистрации сигналов из мышечных клеток личинки. Поместите планшет для препарирования на электрофизиологический микроскоп и погрузите образец в буфер HL 3.1 с добавлением кальция.

Затем закрепите электрод ванны так, чтобы он контактировал с раствором. Всасывающий электрод используется для стимуляции периферических нервов, иннервирующих мышцу. Сначала установите в чашку всасывающий электрод, чтобы избежать вибраций при введении внутриклеточного электрода в мышцу.

После помещения электрода в чашку расположите его рядом с мотонейроном, иннервирующим шестую мышцу. В третьем абдоминальном сегменте примените осторожное всасывание, пока перерезанный нерв не окажется внутри стеклянной пипетки. Будьте осторожны, чтобы не растянуть нервы при создании вакуума.

Слегка приподнимите пипетку, чтобы она не касалась мышцы. Затем расположите ее так, чтобы она не натягивала обрезанные нервные волокна. Как только присасывающий электрод будет установлен, расположите регистрирующий электрод для проведения внутриклеточных записей.

Используйте острый микроэлектрод, заполненный 3 M раствором хлорида калия. Расположите регистрирующий электрод над центром шестой мышцы. Отрегулируйте входное смещение так, чтобы при погружении в банный раствор значение прибора было равно нулю.

Медленно опустите электрод и при большом оптическом увеличении приблизьте его к мышце, пока он не коснется поверхности мышечной ткани. Чтобы подтвердить проникновение в мышцу, наблюдайте за показаниями осциллографа. Потенциал покоя мембраны должен составлять не менее -60 millivolts.

Теперь должен стать виден спорадический миниатюрный потенциал пластинки. После установки регистрирующего электрода дайте клеткам стабилизироваться в течение одной минуты. Перед началом регистрации используйте Axon HS-2 (головной усилитель) и усилитель AxoClamp 2B для обнаружения изменений мембранного потенциала.

Зажим оси two B подключен к компьютеру, на котором через оцифровщик данных 1322 A, преобразующий сигнал в цифровую форму, работает программное обеспечение P clamp. Запись мембранного потенциала осуществляется на ПК. С помощью программного обеспечения clamp X подавайте стимулы на моторный аксон для генерации возбуждающих мембранных потенциалов или EPSP.

После генерации EJP запишите миниатюрные EJP в течение трехминутного периода без синаптической стимуляции. Для анализа трасс и определения амплитуды и частоты mini EJP можно использовать программное обеспечение Soft mini analysis. Для генерации EJP.

Используйте восьмиканальный генератор импульсов для стимуляции проксимального конца перерезанного моторного нейрона. Настройте генератор на подачу прямоугольных импульсов напряжения длительностью 0,3 millisecond. Установите интервал в 5 second между стимулами для восстановления синапсов.

На НМС зарегистрируйте не менее 10 вызванных потенциалов от каждой мышцы и вычислите среднее значение амплитуд. На данном рисунке показана типичная запись от шестой мышцы личинки дикого типа sal с вызванными ответами ПСПК и спонтанными мини-ПСПК. Мы только что продемонстрировали вам способ регистрации потенциалов с нервно-мышечного синапса личинки drosophila. При выполнении данной процедуры важно помнить, что препарирование должно быть завершено в течение 3–10 минут, а электрофизиологические записи следует начинать немедленно, пока клетки остаются жизнеспособными и функциональными.

Если препарирование затянется, потенциал покоя мембраны мышечных клеток упадет ниже -60 мВ, что будет слишком низким значением для регистрации. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.