Channelrhodopsin2 опосредованная стимуляция синаптические потенциалы в Drosophila Нервно-мышечная переходов

Данная процедура начинается с выращивания дрозофил. Личинок третьего возраста с соответствующим генотипом выращивают на корме, содержащем полностью транс-ретинол. Каждую личинку закрепляют булавками за голову и хвост.

Затем FLA расправляют. После этого пересекают головной мозг и задние нервы, чтобы остановить ритмическую двигательную активность. Далее настраивают и фокусируют источник синего светодиодного излучения с блоком управления на препарате.

Наконец, с помощью острого электрода проткните мышцу шесть. Затем подайте световые импульсы с помощью источника напряжения. Здравствуйте, я Николас Марстейн из лаборатории доктора Лесли Гриффит с кафедры биологии Университета Брандейса.

Здравствуйте, я Стефан Пулвер, также из лаборатории Гриффита. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру возбуждения синаптических потенциалов при отсутствии канала root absent 2 в нервно-мышечном соединении личинки Drosophila. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения синаптической физиологии Drosophila.

Мы также используем этот метод для обучения студентов синаптической физиологии и в рамках лабораторных работ. Итак, приступим. Для начала работы с данным протоколом поддерживайте линии мух UAS channel redsin two и 3 7, 1 gal four в отдельных флаконах со стандартной питательной средой для дрозофил.

Соберите девственных особей из, так, 3 7, 1 гал, четырех линий мух и самцов из UAS channel redsin. Две линии. Затем приготовьте среду для мух, смешанную с 1 mM all-trans retinol (ATR). Для этого расплавьте обычную среду для мух в микроволновой печи в течение примерно одной минуты.

После расплавления дайте среде остыть примерно на 30–60 секунд, затем добавьте 100 µL 100 mM a TR в 100% этаноле на каждые 10 mL среды для мух. Когда пробирки со средой, содержащей a TR, будут готовы, поместите в каждую пробирку собранных самцов и самок. Поместите пробирки в темное место при температуре от 22 до 25 °C, чтобы мухи могли спариться и отложить яйца; подождите четыре-пять дней, пока не появятся личинки третьей instar.

На данном этапе взрослых мух можно утилизировать. Теперь можно приступить к установке электрофизиологической установки. Прикрепите окуляр любого диссекционного микроскопа к источнику синего светодиодного (LED) света с радиатором.

Используя стойку и зажим, прикрепите магнитное основание к окуляру и светодиодному источнику света. Поместите магнитное основание на пневматический стол электрофизиологической установки. Затем подключите источник света к цепи управления, а цепь управления — к внешнему источнику напряжения.

Мы используем выходное напряжение системы сбора электрофизиологических данных PowerLab производства ADInstruments. После подключения к источнику напряжения подайте импульсы от одного до пяти вольт на схему управления для активации синего света; отрегулируйте магнитное основание и источник света так, чтобы луч синего света был сфокусирован на области, где будет проводиться диссекция личинки. После выполнения необходимых настроек можно переходить к диссекции личинки.

Для начала диссекции установите шесть булавок диаметром 0,1 мм в дно чашки, выстланной спогаром. Извлеките личинок третьего раздела (star larvae) из питательной среды и поместите их в любую пластиковую чашку Петри. Промойте личинок физиологическим раствором, чтобы удалить прилипшие частицы корма.

Затем поместите личинки в препаровальную чашку рядом с извлеченными булавками и заполните чашку физиологическим раствором наполовину. Теперь расположите личинок так, чтобы были видны две серебристые трубки, проходящие вдоль дорсальной поверхности животного. Эти серебристые трубки представляют собой трахеи.

Вставьте большую булавку непосредственно в хвост между трахейными трубками. Прижмите личинку и введите вторую большую булавку в голову. При введении булавки обязательно вытяните тело вдоль оси.

С помощью ножниц сделайте небольшой разрез рядом с хвостом. Продолжите разрез вдоль всего тела. Убедитесь, что кончики ножниц приподняты, чтобы избежать повреждения вентральных нервов и/или мышц брюшной стенки.

Закрепите четырьмя булавками четыре угла тела животного. Теперь вскройте среднюю часть. Воткните булавки в препарировочную чашку так, чтобы разложить тело животного «филе».

Также закрепите препарат булавками, используя пинцет и ножницы. Удалите пищеварительные органы, трахею и жировые тела животного. Промойте препарат физиологическим раствором.

После промывания с помощью микрохирургических ножниц найдите лобные доли и вентральный ганглий препарата. Осторожно перережьте вентральный ганглий сразу за лобными долями. После завершения диссекции переходите к стимуляции синим светом и регистрации мышечного отклика.

Для регистрации мышечной активности вытяните электрод с сопротивлением от 10 до 20 МОм. С помощью электронного вытягивателя электродов заполните вытянутый электрод 3 M KCl. Поместите заполненный электрод в держатель.

Теперь поместите препарат личинки на установку под диссекционный микроскоп. Отрегулируйте синий свет так, чтобы препарированный образец находился в центре светового луча. Найдите шестую мышцу или M6 в любом сегменте стенки тела личинки; используя микроманипулятор, осторожно введите электрод в M6 и зафиксируйте быструю гиперполяризацию мышцы.

Потенциалы покоя мембраны должны составлять от −30 мВ до −70 мВ. После правильного введения электрода подайте на управляющую цепь импульсы напряжения длительностью от 20 до 100 мс. Постепенно увеличивайте напряжение, подаваемое на управляющую цепь.

Следите за возникновением возбуждающих синаптических потенциалов в мышечной клетке. Здесь представлен типичный результат, демонстрирующий возбуждающий синаптический потенциал, вызванный короткими импульсами света. Амплитуда возбуждающего синаптического потенциала, показанная здесь, представляет собой суммарную амплитуду от двух двигательных нейронов, оба из которых активируются.

M шесть. Более низкая интенсивность или меньшая продолжительность светового воздействия позволяют выявить возбуждающий постсинаптический потенциал меньшей амплитуды от одного двигательного нейрона. Мы только что продемонстрировали вам способ проведения стимуляции синаптических потенциалов на нервно-мышечном соединении с использованием оптогенетики.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что во время диссекции нельзя повредить стенку тела препарата. Также следует учитывать, что даже если сразу после диссекции препарат проявляет чрезмерное возбуждение, со временем он успокоится, что позволит получить качественные записи. При прокалывании мышц будьте осторожны, чтобы не пройти глубже первого мышечного слоя и не повредить стенку тела.

Когда ваш электрод вставлен в стенку тела. Иногда можно зафиксировать гиперполяризованные потенциалы, даже если вы на самом деле не находитесь в мышечной клетке. Вот и все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.