Визуализация антиген Конкретные CD4 + Т-клеток с использованием МНС класс II тетрамеров

Особенность анализа TEER заключается в том, что он позволяет напрямую визуализировать антигенспецифические Т-клетки. Измерение TEER является основным уникальным аспектом нашего анализа, который сочетается с этапом амплификации.

Как известно, мы изолируем Т-клетки, а затем выращиваем их в среде, которая обогащает образец интересующими нас Т-клетками. После этого мы можем специфически пометить только эти клетки и визуализировать их с помощью проточного цитометра. В предыдущих методах анализа, таких как использование CFSE или тесты на пролиферацию, которые применяются на протяжении десятилетий, можно было получить лишь общие суммарные показатели того, что происходит со всей популяцией Т-клеток.

Однако в организме присутствуют миллионы T-клеток, которые распознают огромное разнообразие паттернов. Если вам повезет, возможно, только одна из 200 000–300 000 клеток в образце будет именно той, которую вы ищете. Именно поэтому в данном анализе предусмотрены этапы обогащения.

Затем, используя контрольный номер, и поскольку окрашивание проводится напрямую, вы можете визуализировать на фоне общего числа клеток популяцию, составляющую менее 1%. Таким образом, вы сможете заметить крайне малые различия и получить достаточно точный подсчет количества T-клеток в данном образце крови, то есть у данного индивидуума, которые распознают интересующий вас паттерн. Но на этом возможности не заканчиваются, так как тетрамеры позволяют не только маркировать эти T-клетки, но и изолировать их для дальнейшего анализа.

И тетеры, которые вы используете, на самом деле изготовлены здесь, в BRI, верно? Да. Мы одна из очень немногих лабораторий в стране, которым удалось успешно создать тетеры второго класса. Мы намерены распространять эти реагенты по себестоимости в любые лаборатории, заинтересованные во внедрении этой технологии.

Как вы считаете, какие аспекты данного анализа являются наиболее сложными или проблемными при его воспроизведении в других лабораториях? Что ж, на мой взгляд, их два: один из них — это выращивание T-клеток. Этот процесс во многом представляет собой своего рода искусство.

Вам почти ежедневно приходится принимать решения о том, нуждаются ли клетки в дополнительных питательных веществах или в дополнительном пространстве для роста. А вторая часть, которая, по моему мнению, является наиболее сложной для неопытного оператора, — это непосредственно анализ данных. То есть определение того, какая часть сигнала действительно представляет собой положительный ответ, а какая обусловлена просто, скажем, физическими процессами и притяжением.

Тот факт, что всё обладает определенной степенью адгезии, также требует большого опыта, особенно в случаях, когда общий ответ будет несколько слабым. Каким образом информация, полученная с помощью этого анализа, может принести пользу пациентам на данном этапе? Одним из первых признаков у любого пациента с аутоиммунным заболеванием является своего рода совокупность антител, специфичных для этого заболевания.

Из фундаментальных основ иммунологии известно, что любому антительному ответу всегда предшествует Т-клеточный ответ. Таким образом, если в группе риска удастся зафиксировать всплеск активности Т-клеток, предшествующий образованию антител, это поможет определить новый уровень риска развития аутоантител у отдельных лиц, что, в свою очередь, может открыть окно для проведения интервенционной терапии. В данной процедуре будет выполнена очистка и экспансия антигенспецифических CD4+ Т-клеток с их последующей визуализацией с использованием реагентов и оборудования teters в ламинарных шкафах биологической безопасности II класса.

Это будет основная рабочая зона для проведения процедуры. Конические пробирки объемом 50 мл, основная пробирка для выделения PBMC, 10X PBS. Раствор должен быть без кальция и магния, обернут фольгой для защиты от света, дозатор-шприц, стерильные наконечники для дозаторов CoStar 10 мл, аэрозольные контейнеры с вставками на 50 мл, используемые для предотвращения загрязнения центрифуги кровью.

Центрифужные переносные пипетки GS six R, пипетки Пастера, гемолитический буфер, содержащий 8,3 г/л хлорида аммония, 1,0 г/л бикарбоната натрия, 0,04 г/л деионизированного ЭДТА натрия, 0,2% раствор трипанового синего в PBS, гемоцитометр, коническая пробирка объемом 15 мл, рабочий буфер, содержащий PBS с добавлением 2 мМ ЭДТА и 5 г/л.

Набор для выделения BSA max CD four isolation kit two приобретен в Milin biotech; магнитный блок EP приобретен в stem cell technologies. С аналогичной эффективностью могут быть использованы и другие платформы для магнитного обогащения клеток. Полипропиленовая пробирка объемом 5 milliliter; среда RPMI 1640 с добавлением 25 millimolar HEPES для приготовления среды для Т-клеток; объединенная сыворотка крови человека для дополнения среды для Т-клеток; pen strip для дополнения среды для Т-клеток; бутылочный фильтр 0.22 micron объемом 500 milliliters; стерильный 48-луночный планшет для экспансии культур in vitro; инкубатор 37 degree CO2; раствор синтетического пептида, содержащего интересующий эпитоп, в концентрации 20 milligram per milliliter.

Для визуализации антигенспецифических T-клеток использовались пятимиллилитровые полистирольные пробирки для FACS, загруженные пептидами; для окрашивания антигенспецифических T-клеток применялись антитела к CD3, CD4 и CD25. Используйте проточный цитометр FACSCalibur или эквивалентное оборудование. Перед началом процедуры подготовьте все необходимые материалы и оборудование на рабочем столе.

В данной демонстрации будут представлены следующие этапы: выделение PBMC, сепарация CD4-положительных T-клеток, культура экспансии in vitro, визуализация T-клеток с помощью микроскопии или окрашивания. Этап 1: выделение PBMC.

Получите образец крови. Кровь следует собирать в шприцы или пробирки для крови и антикоагулировать гепарином в соотношении 1:50 для предотвращения свертывания; ожидаемый выход составляет около 1 миллиона PBMC на миллилитр крови. Около 40% из них будут представлять собой CD4-положительные T-клетки.

Разлейте кровь по коническим пробиркам объемом 50 мл. По 25 мл крови в каждую пробирку. Осторожно перемешайте кровь перед свертыванием ALI, чтобы равномерно распределить плазму.

Добавьте PBS, чтобы общий объем составил 40 мл, и создайте подслой, набрав в пипетку 11 мл и вставив её в пробирку для крови, при этом осторожно отсоединив дозатор пипетки. Жидкость из пипетки будет медленно стекать на дно пробирки. После выравнивания уровней медленно извлеките пипетку из пробирки, закройте пробирки крышками и поместите их в аэрозольные контейнеры.

Плотно закройте канистры и центрифугируйте при 900 ×g в течение 20 минут без торможения. Критически важно не использовать торможение в конце этого цикла, так как сила торможения может нарушить слой клеток после центрифугирования. PBMC должны образовать отчетливый белый слой между желтой плазмой сверху и прозрачным осадком снизу.

Осторожно снимите слой лейкоцитов с помощью переносной пипетки и перенесите его в новую пробирку. Вместе с PBMC может быть забран небольшой объем плазмы и фибрина, однако следует избегать попадания слоя эритроцитов. Обычно на этом этапе содержимое двух пробирок с кровью можно объединить в одной пробирке с клетками.

Для увеличения размера осадка добавьте PBS, чтобы общий объем составил 15 миллилитров, и центрифугируйте при 500 ×g в течение 15 минут с медленным торможением и использованием аэрозольных защитных колпачков; аспирируйте жидкость с помощью пастельной пипетки, стараясь не задеть осадок. Обработайте гемолитическим буфером, добавив от пяти до шести миллилитров в каждую пробирку и аккуратно перемешав для удаления комков. Инкубируйте не более пяти минут.

Добавьте PBS, чтобы довести общий объем до 50 milliliters, и центрифугируйте при 230 ×g в течение 10 минут. При низкой скорости торможения аэрозольные колпачки для этих медленных циклов центрифугирования больше не требуются. Промойте дважды: аспирируйте жидкость, заполните пробирку PBS с помощью пастер {pipette} и центрифугируйте при 230 ×g в течение 10 минут. Перед последним этапом промывки возьмите аликвоту ресуспендированных клеток, разбавьте трипановым синим и подсчитайте их с помощью гемоцитометра.

Данный подсчет количества клеток определит объемы реагентов, используемых при сепарации Т-клеток. Шаг два, сепарация CD4-положительных Т-клеток: аспирируйте жидкость и добавьте рабочий буфер, чтобы довести общий объем до 40 µL на 10 миллионов клеток. Обычно для этого требуется 30 µL буфера плюс остаточный объем осадка.

Перенесите данный объем в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте коктейль антител из набора для выделения CD4 из расчета 10 µL на 10 миллионов клеток, закройте пробирку крышкой и выдержите на льду в течение 10 минут. Извлеките пробирку из льда, снимите крышку и добавьте 30 µL рабочего буфера на 10 миллионов клеток.

Добавьте магнитные бусины из набора для изоляции CD4. Используйте 20 µL на 10 миллионов клеток, закройте пробирку крышкой и выдержите на льду в течение 15 минут. Добавьте 10 объемов промывочного буфера, затем центрифугируйте при 230 ×g в течение 10 минут.

Во время центрифугирования подготовьте магнит и полипропиленовую пробирку объемом пять миллилитров на рабочем столе. Отсосируйте жидкость из осадка клеток. Добавьте два миллилитра рабочего буфера и удалите комочки с помощью переносящей пипетки.

С помощью той же трансфер-пипетки перенесите клетки в пробирку объемом 5 мл и инкубируйте на магните в течение 15 минут. Осторожно слейте фракцию Т-клеток, положительных по CD4, в маркированную пробирку объемом 15 мл, перевернув магнит и слив весь объем, кроме последней капли. Добавьте еще 2 мл рабочего буфера в пробирку объемом 5 мл и снимите ее с магнита.

Осторожно смойте четыре отрицательные клетки CD со стенок пробирки и перенесите их в маркированную пробирку объемом 15 мл. Добавьте в каждую пробирку по два миллилитра среды для Т-клеток. Отберите аликвоты для подсчета клеток и центрифугируйте при 230 ×g в течение 10 минут.

Разбавьте аликвоты клеток трипановым синим и подсчитайте их с помощью гемоцитометра. Полученные данные о количестве клеток определят число лунок, используемых для экспансионного культивирования. Шаг три.

При экспансии in vitro аспирируйте жидкость из осадка CD4-положительных и CD4-отрицательных клеток в соответствии с их количеством. Добавьте среду к CD4-положительным клеткам, чтобы довести концентрацию до 3 миллионов клеток на мл. Добавьте среду к CD4-отрицательным клеткам, чтобы довести концентрацию до 10 миллионов клеток на мл.

Для экспансии культуры требуется 3 миллиона CD4-отрицательных клеток на лунку и от 2 до 3 миллионов CD4-положительных клеток на лунку. Как правило, CD4-положительные клетки являются лимитирующей популяцией. Распределите CD4-отрицательные клетки по соответствующему количеству лунок в 48-луночном планшете.

Добавив по 300 мкл в каждую лунку, поместите планшет в инкубатор при 37 °C на один час. Извлеките планшет из инкубатора, промойте лунки, добавив 500 мкл свежей среды и осторожно перенося жидкость туда и обратно от 12 до 20 раз с помощью переносной пипетки, после чего удалите всю жидкость. Эта промывка позволит оставить слой адгезивных антигенпрезентирующих клеток.

По завершении промывки добавьте в каждую лунку достаточное количество среды, чтобы смочить дно, примерно 100 µL. В противном случае адгезивные клетки A высохнут. При необходимости добавьте в каждую лунку от 2 до 3 миллионов CD4-положительных клеток.

Добавьте дополнительную среду, чтобы довести общий объем в каждой лунке до одного миллилитра. В каждую лунку добавьте необходимый пептид. Типичная концентрация для стимуляции составляет 10 µg/mL.

В завершение поместите планшет в инкубатор при 37 °C на семь дней. По истечении семи дней добавляйте по 50 µL hemo IL 2 в каждую лунку каждый последующий день.

Следите за ростом клеток с помощью микроскопа. В лунках, где клетки еще не достигли конфлюэнтности, удалите половину среды, добавьте свежую среду и 50 µL IL-2. Для разделения конфлюэнтных лунок ресуспендируйте клетки и перенесите половину из них в пустую лунку. Добавьте свежую среду и 50 µL IL-2, после чего верните клетки в инкубатор. Растущие клетки будут готовы к окрашиванию TEER через 13–15 дней культивирования.

Шаг четыре, визуализация Т-клеток с помощью окрашивания тетрамерами; приобретите или соберите тетрамеры, соответствующие комбинациям пептида и MHC, которые использовались для стимуляции CD4-положительных Т-клеток. Извлеките планшет из инкубатора.

Осторожно отберите половину среды из каждой лунки. Перенесите аликвоту клеток из каждой лунки, обычно 75 µL или около 50 000 клеток, в полистирольную фалькон-пробирку объемом 5 mL, добавьте тетра-антитела (обычно 1 µL на 50 µL общего объема) и поместите в инкубатор при 37 °C на один час. Также рекомендуется окрасить вторую аликвоту из каждой лунки не соответствующими антителами в качестве отрицательного контроля. Маркируйте клетки антителами anti-CD3, anti-CD4 и anti-CD25.

Можно использовать дополнительные или альтернативные маркеры антител. Однако не используйте антитела, меченные PE, так как этот канал на данный момент должен быть зарезервирован для теems. Также используйте дополнительные клетки для мечения любого одноцветного контроля или изотипического контроля.

Инкубируйте клетки, меченные антителами, от 15 до 30 минут при четырех градусах. Промойте каждую пробирку с помощью 0,5–1 мл промывочного буфера и центрифугируйте при 230 ×g в течение 10 минут. Осторожно слейте жидкость из пробирок, откалибруйте проточный цитометр, используя калибровочные микросферы, пробирки с контролем одного цвета, изотипические контроли и так далее.

Проанализируйте содержимое каждой пробирки с помощью проточного цитометра. Тетра-положительные клетки должны представлять собой отдельную популяцию среди экспандированных CD4-положительных Т-клеток. Тетра-положительные клетки обычно являются CD25-положительными и часто характеризуются высоким уровнем экспрессии CD4.