Диапазона измерений репликативной Жизнь в почкующихся дрожжей

Почкующийся дрожжевой грибок Croce Visi широко используется для изучения биологии старения. В данной статье мы представляем общий протокол измерения репликативного срока жизни материнских клеток дрожжей. Здравствуйте, я Кристен Стеффен из лаборатории Брайана Кеннеди с кафедры биохимии Вашингтонского университета.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру измерения репликативного срока жизни материнских клеток дрожжей. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения генов, влияющих на продолжительность жизни дрожжевых клеток. Приступим.

Для проведения эксперимента по определению репликативного срока жизни и подготовки дрожжевых клеток к этому анализу необходимо подготовить чашки с твердой средой YEPD. При приготовлении чашек с агаром YEPD соблюдайте соответствующие правила стерильности. Подготовьте не менее двух чашек на каждые четыре-пять штаммов, которые будут анализироваться в эксперименте по определению срока жизни.

Эти чашки следует подготовить как минимум за два дня до начала эксперимента по определению продолжительности жизни и дать им высохнуть перед началом анализа. Если эксперимент не будет проведен в течение четырех-пяти дней после заливки чашек, их необходимо обернуть парафильмом или пластиком и поместить в охлаждаемый инкубатор для предотвращения высыхания. Извлеките штаммы дрожжей из замороженных стоков и проведите посев для получения единичных колоний.

На чашки с агаром YEPD. До шести штаммов можно легко посеять на одну чашку YEPD, разделив её на равные сектора. Инкубируйте клетки при 30 °C в течение двух дней.

После инкубации извлеките клетки из инкубатора и перенесите клетки из одной колонии на свежую чашку с YEPD. На этом этапе штаммы, подлежащие анализу, должны быть промаркированы таким образом, чтобы эксперимент по определению репликативного срока жизни проводился в «слепом» режиме, при котором исследователи не знают идентичности отдельных штаммов.

Затем инкубируйте клетки с нанесенными патчами при 30 °C до следующего вечера. Снимите клетки и перенесите небольшие патчи клеток каждого покрытого штамма на свежие чашки с YEPD. Эти чашки будут использоваться в качестве экспериментальных для определения репликативного срока жизни.

Клетки для анализа следует высевать полосками вдоль вертикальной линии в левой части чашки с YEPD. Не переносите слишком много клеток на одну свежую чашку с YEPD. Поскольку это приведет к избыточному росту клеток во время инкубации в течение ночи и повлияет на их репликативный период жизни, оптимальным количеством является примерно от трех до пяти полосок на чашку.

При условии, что анализ репликативного срока жизни будет проведен для 20 клеток из каждого участка, теперь эксперимент по определению срока жизни полностью подготовлен, и все, что остается, — это инкубировать образцы в течение ночи при комнатной температуре. Затем завтра можно будет приступить к микродиссекции, чтобы расположить дрожжевые клетки на предметном стекле и выделить первичные дочерние клетки для анализа репликативного срока жизни.

Используйте микроскоп, оснащенный аппаратом для микродиссекции, подходящим для дрожжей. Перенесите примерно 50 клеток первого штамма-патча в область планшета, удаленную от патчированных клеток. Если предметный столик вашего микроскопа имеет градуировку, ее можно использовать, чтобы облегчить поиск клеток при последующих итерациях.

Иногда клетки могут застрять в игле, что может стать проблемой, если они выйдут в неподходящий момент. Чтобы убедиться, что игла чистая и на ней нет клеток, несколько раз коснитесь ею поверхности агара. Затем сделайте отверстие в агаре, с силой проткнув его поверхность иглой.

Это отверстие будет служить маркером для ориентации на планшете во время последующих этапов диссекции и удаления отдельных клеток. Следите за тем, чтобы в отверстие не попали клетки дрожжей, иначе они разрастутся и образуют колонию непосредственно над ним. Расположите отдельные клетки дрожжей вертикально в 20 равномерно распределенных позициях, оставляя расстояние от одного до трех диаметров иглы между каждой клеткой.

Для каждых нескольких клеток помещайте по две клетки рядом друг с другом в одну и ту же позицию в линии вместо одной. Это обеспечит избыточность при отборе девственных дочерних клеток. Если одна из перенесенных клеток не разделится между 10-й и 11-й позициями в линии, создайте в агаре горизонтальный ряд из семи или восьми лунок.

Это послужит маркером для ориентации на планшете во время последующих диссекций и удаления дочерних клеток. Опять же, будьте осторожны, чтобы дрожжевые клетки не попали в лунки, иначе они разрастутся и образуют колонию. Повторите эту процедуру для каждого патча на планшете, продолжая располагать клетки вертикально вдоль той же оси.

Важно помнить, что при создании отверстий в AER количество создаваемых отверстий должно соответствовать номеру патча: одно отверстие для первого патча и два отверстия для второго. После того как клетки будут распределены по массиву для каждого патча, закройте планшет парафильмом и инкубируйте при 30 °C примерно в течение двух часов. Помните, что с этого момента все планшеты должны быть закрыты парафильмом, за исключением моментов проведения диссекции.

Чтобы предотвратить высыхание, повторите эту процедуру для каждой лунки. В данном эксперименте для анализа продолжительности жизни важно убедиться, что каждая клетка изначально является первичной дочерней клеткой.

Для этого сначала извлеките планшеты из инкубатора и убедитесь, что большинство клеток в массиве прошли через деление. Перед нами клетки, которые были выровнены ранее; видно, что спустя два часа в инкубаторе они начали делиться. Теперь у нас есть материнская клетка — более крупная, прикрепленная к телу, — и первичная дочерняя клетка, которая и будет использоваться для начала отсчета продолжительности жизни.

Если для завершения деления клеток требуется дополнительное время, верните планшет в инкубатор. Начиная с первой клетки массива, используйте иглу, чтобы отделить дочерние клетки от материнской, аккуратно прикладывая иглу к прикрепленным клеткам.

Иногда бывает полезно слегка постучать по основанию микроскопа, пока игла касается клеток. Затем поместите отделенную дочернюю клетку в вертикальный ряд клеток на место материнской клетки, временно отодвинув ее и любые дополнительные дочерние клетки в сторону. Повторите эти действия для каждой клетки массива.

Если клетка не разделилась, возьмите дочернюю клетку из одной из избыточных клеток, расположенных рядом с исследуемой клеткой. По завершении у вас должно получиться по 20 дочерних клеток для каждого патча, выровненного по вертикали на планшете для определения продолжительности жизни. Соберите все материнские и лишние дочерние клетки в одну группу и перенесите их обратно в область рядом с патчами, называемую «кладбищем» (graveyard).

Важно держать нежелательные клетки вдали от клеток, проходящих анализ продолжительности жизни, чтобы предотвратить образование микроколоний и истощение локальных питательных веществ. После разделения клеток снимите их с планшета и инкубируйте при 30 °C в течение примерно двух часов. Повторите эти шаги для каждого планшета в эксперименте.

Для измерения репликативной способности отдельных клеток необходимо подготовить листы данных о продолжительности жизни. Лист данных может представлять собой простую таблицу, в которой каждая строка соответствует отдельной материнской клетке, а каждый столбец — определенному возрастному этапу. Обязательно промаркируйте каждый лист данных в соответствии с количеством анализируемых штаммов.

Для начала извлеките планшеты из инкубатора и убедитесь, что в большинстве ячеек массива произошло как минимум одно деление клеток. Если для завершения деления клеток требуется дополнительное время, верните планшет в инкубатор. Начиная с первой ячейки массива на первом планшете, визуально осмотрите материнскую и дочернюю клетки (или группу клеток), чтобы определить количество произошедших делений.

Обычно легко определить количество дочерних клеток, produced материнской клеткой, основываясь на характерном расположении клеток. В данном случае определить количество образовавшихся клеток очень просто, так как их две, они одного размера и обе меньше материнской клетки. Запишите количество дочерних клеток, образованных материнской клеткой, в соответствующее поле листа оценки продолжительности жизни.

Затем с помощью иглы отделите дочерние клетки от материнской клетки, как было описано ранее: осторожно поместите иглу на прикрепленные клетки и слегка постучите по основанию микроскопа, пока игла опирается на клетки. Оставьте материнскую клетку в ее исходном положении в вертикальной линии, а дочернюю клетку или клетки временно переместите в сторону. Повторите эти действия для каждой клетки массива.

В завершение соберите все отбракованные дочерние клетки и перенесите их в зону удаления («кладбище»), расположенную рядом с исходными участками. Загерметизируйте чашку парафильмом и инкубируйте при 30 °C в течение двух-трех часов. Повторите процедуру отбраковки дочерних клеток и инкубации.

Этап для каждой планшетки в эксперименте. Повторяйте всю эту процедуру до тех пор, пока все материнские клетки не перестанут делиться. Имейте в виду, что по мере старения материнских клеток прогрессия клеточного цикла замедляется, поэтому в дальнейшем будет целесообразно инкубировать планшетки в течение более длительных периодов времени между контрольными точками возраста; после этого планшетки можно поместить при температуре 4 °C на ночь.

Необработанные данные, полученные в результате эксперимента по определению репликативного срока жизни, представляют собой список чисел, соответствующих количеству дочерних клеток, произведенных каждой материнской клеткой в каждой временной точке. Как показано здесь. Путем суммирования значений в каждой строке оценочного листа определяется репликативный срок жизни для каждой материнской клетки.

Данные из других клеток той же экспериментальной группы могут быть объединены для построения кривой выживаемости и проведения статистических расчетов. Кривая должна быть примерно согласована с кинетикой Гомпертца-Makeam, имея сигмоидальную форму с низкой смертностью на ранних этапах, за которой следует относительно быстрое снижение выживаемости и выполаживание кривой в более позднем возрасте. Мы только что продемонстрировали вам, как проводить эксперимент по определению репликативного срока жизни дрожжей.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что клетки продолжают делиться, когда они не находятся в условиях охлаждения. Поэтому не забудьте поместить планшеты при температуре 4 °C на ночь, чтобы к утру количество дочерних клеток не стало слишком большим для подсчета. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.