Изучение, зависящими от возраста геномной нестабильности использованием С. CEREVISIAE Хронологические Модель продолжительность жизни

Общая цель данной процедуры заключается в изучении возраст-зависимой геномной нестабильности у дрожжей путем сочетания анализа хронологического срока жизни с набором простых тестов на повреждение ДНК и возникновение мутаций. Это достигается путем отбора проб из культур хронологического старения каждые два дня и проверки жизнеспособности с помощью определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ). Следующим этапом процедуры является исследование мутаций ДНК путем отбора проб из стареющих культур и высева клеток на селективную среду, специфичную для данных мутаций.

В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие изменения в мутациях ДНК в процессе хронологического старения дрожжей путем нормализации результатов анализа мутаций по жизнеспособности. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области старения, такие как механизмы, связывающие старение и геномную нестабильность. Для анализа хронологической продолжительности жизни дрожжей или CLS сначала инокулируют одну колонию дрожжей в один миллилитр синтетической полноценной глюкозной среды или среды SDC и инкубируют в течение ночи с перемешиванием при 30 °C. На следующий день разбавляют ночную культуру в 10 миллилитрах свежей среды SDC до OD 600 от 0,05 до 0,1 и инкубируют с перемешиванием при 30 °C в течение трех дней.

На третий день, когда клетки находятся в стационарной фазе, разведите каждый образец Eloqua в 10 000 раз в автоклавированной воде, затем отберите две аликвоты по 10 µL из колбы и высейте по 10 µL каждой разведенной культуры на чашку с средой A-Y-E-P-D. Инкубируйте чашку при 30 °C до появления колоний. Количество появившихся колоний или колониеобразующих единиц из культуры третьего дня считается 100% выживаемостью.

Продолжайте в последующие дни отбирать аликвоты из стареющей культуры для посева. Соответственно корректируйте коэффициенты разведения, чтобы в результате анализа КОЕ получилось от 20 до 100 колоний. Отбор проб прекращают, когда жизнеспособность культуры падает ниже 1% (обычно между 11-м и 13-м днями); жизнеспособность клеток также может изучаться на клетках, стареющих на планшетах.

Для начала данного анализа инокулируйте одну колонию в один миллилитр синтетической полной глюкозной среды и инкубируйте в течение ночи при встряхивании при 30 °C. Когда культура вырастет примерно до 10⁸ клеток на миллилитр, разбавьте культуру автоклавированной водой до концентрации 100–200 клеток на 10 µL и 1000 клеток на 10 µL. Для каждого штамма подготовьте набор из 8–20 чашек SDC без триптофана, промаркировав их в соответствии с плотностью посева.

Чтобы обеспечить возможность подсчета от 10 до 100 колоний, учитывая снижение жизнеспособности клеток в процессе старения, на каждую чашку высеют две аликвоты разведенной культуры объемом от 10 до 30 µL. Инкубируйте набор чашек при 30 °C на протяжении всего анализа продолжительности жизни. В день посева и далее каждые два дня извлекайте одну чашку и по каплям добавляйте 0,5 mL триптофана, чтобы обеспечить рост жизнеспособных клеток. Инкубируйте чашку при 30 °C дополнительно в течение 48–72 часов.

Через 48–72 часа. Подсчитайте количество КОЕ для определения жизнеспособности в день добавления триптофана для анализа повреждения ДНК и частоты мутаций при хронологическом старении. Ряд штаммов со специальными характеристиками выращивают параллельно со штаммом дикого типа для анализа CLS дрожжей.

Частоту спонтанных мутаций можно оценить, измеряя частоту развития устойчивости к L-канаванину в хронологически стареющей культуре. Мутации в гене CAN1, который кодирует плазматическую аргинин-пермеазу, делают клетки устойчивыми к аналогу аргинина L-канаванину. Устойчивые к канаванину клетки будут расти на пластинах с синтетической полноценной средой без аргинина, дополненной L-канаванинсульфатом. Измерение частоты трип-положительной реверсии в штамме, содержащем янтарную мутацию в кодирующей последовательности TRIP1, позволяет оценить скорость замены оснований в процессе хронологического старения дрожжей.

Клетки с положительной реверсией будут расти на средах без триптофана. Лизис-негативный штамм EH1-50 имеет сдвиг открытой рамки считывания на +4, что приводит к ауксотрофии по лизину; это может быть исправлено небольшими инсерционными или делеционными мутациями. Ревертанты будут отобраны на средах без лизина для выявления грубых хромосомных перестроек (gcr).

Используется мутантный штамм, в котором локус HX T 13, расположенный в 7,5 kb теломерно от гена can1 на пятой хромосоме, нарушен кассетой U3. Мутации в обоих генах, can1 и U3, делают клетки устойчивыми к L-канаванину и 5-фтор-оротовой кислоте соответственно. Поскольку частота точечных мутаций, возникающих в обоих генах одновременно, низка, анализ частоты устойчивости как к L-канаванину, так и к 5-фтор-оротовой кислоте позволяет оценить частоту GCR для мониторинга уровней гомологичной и негомологичной рекомбинации. В процессе хронологического старения создаются мутанты, несущие либо 100% гомологичные инвертированные повторы, либо 91% гомологичные.

Рекомбинация между IRS в локусе his3 обеспечивает экспрессию функционального белка his3. Следовательно, клетки, в которых произошла рекомбинация, будут расти на средах без гистидина с добавлением галактозы. На третий день, когда клетки перейдут в стационарную фазу, из каждой стареющей культуры будет отобрано соответствующее количество клеток.

Поскольку для всех анализов используется одна и та же процедура, будет обработан только один образец. Для целей данного видео осадите клетки, центрифугируя их в настольной центрифуге. Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в одном миллилитре автоклавированной воды.

Снова удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в 100 µL воды, затем высейте клетки на соответствующие чашки для отбора нужных ревертантов. Инкубируйте чашки при 30 °C; через три-четыре дня подсчитайте КОЕ, после чего нормируйте частоту мутаций по количеству жизнеспособных клеток. На данном графике представлены репрезентативные результаты типичного анализа хронологической продолжительности жизни при сравнении выживаемости клеток дикого типа с выживаемостью мутантов S CH nine delta TOR one delta и RAs two delta.

В жидкой культуре мутанты с отсутствием TOR1, SCH9 или RAS2 демонстрируют увеличение хронологической продолжительности жизни. Кроме того, дефицит SCH9 и RAS2 оказывает аддитивный эффект на повышение долголетия и хронологическую выживаемость при наличии различных источников углерода. Использование анализа жизнеспособности NC2 показано на следующем графике.

В первый день культуры дикого типа SDC разводили и высевали на чашки с отсутствием источников углерода среды SC trip dropout. Чашки SC Tripp dropout, дополненные глюкозой, этанолом или глицерином, инкубировали при 30 °C каждые два дня. Из каждого набора извлекали одну чашку и добавляли соответствующие питательные вещества для обеспечения роста и формирования колоний.

Частота мутаций в зависимости от возраста значительно варьируется в зависимости от штамма, генетического фона, генетических манипуляций, культуры, условий и возраста. В данной таблице представлены типичные результаты, полученные для штамма дикого типа. Репрезентативные результаты синтеза через повреждение показаны на следующем изображении.

Возрастная зависимость увеличения частоты мутаций может быть связана с изменениями в ошибочной репарации ДНК с использованием ядерных экстрактов и различных матриц ДНК. Мы можем оценить транслезионный синтез или TLS в хронологически состаренных клетках. Были проанализированы ядерные экстракты клеток дикого типа, мутанта SCH9Δ и клеток в стационарной фазе в возрасте трех дней.

Продукты TLS с неповрежденной матрицей обозначены сплошными линиями, а продукты TLS с поврежденной матрицей — пунктирными линиями. В ядерных экстрактах долгоживущего мутанта s CH nine delta синтез через повреждение не наблюдался; свободные праймеры обозначены незакрашенной стрелкой. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как проводить анализ хронологического срока жизни и мутаций ДНК у дрожжей.