Идентификация белковых комплексов с количественной протеомики в CEREVISIAE С.

Данная процедура начинается с культивирования штамма-приманки в среде, содержащей обычные аминокислоты для контрольного штамма SLAC и тяжелые изотопные аналоги лизина и аргинина для маркированного штамма. Равные количества обоих штаммов смешивают и лизируют путем растирания с жидким азотом. Сырые лизаты сначала осаждают центрифугированием, а затем очищают путем связывания со сферос-бисерами (spheros beads). Затем клеточный лизат связывают с IgG-бисерами.

Белки, связавшиеся с IgG-гранулами, подвергаются воздействию протеазы, расщепляются и осаждаются. Теперь образец готов к анализу методом масс-спектрометрии. Здравствуйте, я Джесси Чао из лаборатории Лоуна кафедры биологии клеточной среды Института наук о жизни Университета Британской Колумбии.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру количественного протеомного анализа, называемую SILAC, в сочетании с аффинной очисткой. Мы используем этот метод в нашей лаборатории для изучения белковых комплексов.

Итак, приступим. В данной процедуре штамм-приманка содержит обычные аминокислоты, в то время как контрольный штамм SLAC содержит тяжелые изотопы лизина и аргинина. Для начала вырастите по одному литру культур штамма-приманки и контрольного штамма по отдельности до значения, указанного на экране. Затем перелейте культуры в центрифужные пробирки Nalgene объемом 500 milliliter.

Центрифугируйте клетки в осадке при 2 580 RCF, слейте среду и ресуспендируйте осадок в 50 миллилитрах холодного D H2O, перенося клетки в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров. Центрифугируйте пробирки для осаждения клеток при 3000 RCF. На этом этапе осадок можно заморозить при температуре -80 °C.

Важно помнить о необходимости приведения культуры контрольного штамма в соответствие с культурой штамма-приманки в соотношении один к одному по весу сухого осадка. Ресуспендируйте каждый клеточный осадок в 10 миллилитрах буфера NP 40 с добавлением коктейля ингибиторов протеаз в соотношении один к 2000. Смешайте две клеточные культуры, перелив содержимое одной пробирки в другую.

Чтобы начать растирание клеток, сначала налейте жидкий азот в предварительно охлажденную ступку и дайте ему полностью испариться. Затем добавьте в ступку два миллилитра клеточной суспензии. Добавьте жидкий азот для замораживания клеток.

Растирайте клетки до получения мелкого порошка. Повторяйте процесс до полного измельчения всех клеток. Следите за тем, чтобы клетки не разморозились.

При необходимости добавьте жидкий азот. Затем перенесите порошок в охлажденный на льду стакан и разморозьте при комнатной температуре. Когда края начнут оттаивать, добавьте 20 milliliters буфера NP 40 с PIC в соотношении 1:200 после полного размораживания.

Перенесите сырой лизат в пробирки Nalgene объемом 40 мл и центрифугируйте при 16,000 RPM с использованием ротора Sovos SA 600 в течение 30 минут. В ожидании завершения центрифугирования возьмите 300 µL бусин SROs two B и трижды промойте их в 300 µL буфера NP 40. Затем ресуспендируйте бусины в 300 µL буфера до получения суспензии в соотношении один к одному.

Следующим шагом является предварительная очистка клеточного лизата. Для этого сначала перенесите супернатант в новую пробирку и добавьте бусины Spheros two B. Инкубируйте на ротаторе в холодильной комнате в течение 30 минут.

Во время инкубации возьмите 300 мкл SRO с IgG (шесть бусин) и трижды промойте их в 300 мкл буфера NP 40. Затем ресуспендируйте бусины в 300 мкл буфера до получения суспензии в соотношении один к одному. После инкубации осадите SRO центрифугированием.

Поместите две бусины в пробирку. Перенесите супернатант в новую пробирку. Не забудьте сохранить аликвоту клеточного лизата для последующего вестерн-блоттинга.

Затем добавьте IgG-биды. Для более эффективного связывания разделите содержимое по двум пробиркам и инкубируйте на ротаторе в холодильной комнате в течение двух часов. После инкубации соберите биды в хроматографическую колонку при температуре 4 °C.

Обязательно сохраните аликвоту несвязанной фракции. Промойте гранулы 10 мл буфера NP 40.

Затем промойте гранулы тремя миллилитрами буфера TEVC. Снова напомним, что необходимо сохранить аликвоту гранул.

Это отразит эффективность связывания при элюции с бусин. Сначала добавьте 5 µL A-C-T-E-V к 1 mL буфера TEVC. Добавьте буфер TEVC к бусинам и перемешайте.

Для более эффективного перемешивания перенесите содержимое в две пробирки EINOR объемом 1.5 milliliter и инкубируйте на ротаторе в холодильной комнате в течение ночи. Затем осадите гранулы центрифугированием и перенесите элюат в новую пробирку объемом 1.5 milliliter. Промойте гранулы дополнительными 0.5 milliliters буфера TEVC.

Объедините все восемь фракций в одной пробирке. В итоге должно получиться 1,5 миллилитра ELU 8. Сохраните аликвоту TEV Elu 8 для осаждения.

Доведите концентрацию TCA в аликвотах до 25%, используя 100% TCA. Для этого разделите 1,5 мл LU 8 на две пробирки по 750 мкл в каждой. Добавьте в пробирку 250 мкл 100% TCA.

Раствор должен стать мутным. Затем поместите его на лед на 30 минут, периодически перемешивая смесь на вортексе после инкубации.

Центрифугируйте на максимальной скорости в настольной центрифуге в холодном помещении в течение 30 минут. Один раз промойте 500 µL ледяного ацетона, содержащего 0,05 н. соляную кислоту. Затем центрифугируйте в течение пяти минут на максимальной скорости при 4 °C.

Затем однократно промойте образец 500 µL ледяного ацетона и центрифугируйте в течение пяти минут с максимальной скоростью при 4 °C. После центрифугирования осторожно удалите ацетон и высушите осадок для окрашивания серебром. Ресуспендируйте осадок в 50 µL 1× буфера для образцов SDS.

Если вы планируете использовать осажденный белок для анализа методом масс-спектрометрии, рекомендуется проводить осаждение с помощью этанола. Для этого сначала добавьте 20 µg гликогена, затем разведите образцы в пять раз стопроцентным этанолом и доведите концентрацию бикарбоната натрия до 50 mM, используя 2.5 M стоковый раствор при pH 5.0. Перемешайте раствор, переворачивая пробирку.

Оставьте раствор на два часа при комнатной температуре. В завершение разделите содержимое по двум микроцентрифужным пробиркам. Осадите преципитированный белок путем центрифугирования в течение 10 минут при 12 000 g при комнатной температуре.

Аликвоты, сохраненные в ходе процедуры очистки, должны включать предварительно очищенный клеточный лизат, связанную фракцию, несвязанную фракцию и элюированную фракцию. Мы рекомендуем анализировать содержание белков в указанных аликвотах методом вестерн-блоттинга с использованием антител к TAP или методом окрашивания серебром для оценки эффективности связывания и элюирования в эксперименте. На данном геле, окрашенном серебром, были визуализированы очищенный SCS two tap и его взаимодействующие партнеры, которые затем сравнивались с немаркированным контролем на этом вестерн-блоте.

Различные фракции, полученные в процессе очистки SCS two tap, были проанализированы методом вестерн-блоттинга с использованием антител к tap. Заметьте, что после элюции путем расщепления TEV-протеазой SCS two tap мигрировал с более низкой молекулярной массой, и после элюции на IgG-гранулах SCS two tap не осталось. Это подтвердило высокую эффективность очистки.

Мы только что продемонстрировали вам способ очистки белковых комплексов с помощью аффинной очистки с использованием IgG-гранул. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости выровнять массу сухого осадка базового и контрольного штаммов перед началом процесса очистки. Поскольку метод LAC обеспечивает получение несмещенных и количественных данных о партнерах по связыванию белков, мы проводим только первый этап тандемной аффинной очистки (TAP), чтобы минимизировать потерю образца.

Если вы наблюдаете значительный уровень неспецифического связывания, рекомендуется выполнить протокол в полном объеме; его можно найти в руководстве Cold Spring Harbor. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.

Эй, давай, Марк. А, пошли.