Определение белковых комплексов в

Целью данного эксперимента является идентификация белков, их взаимодействий и субъединичного состава нативных комплексов MultiPro из E. coli. Это достигается путем амплификации специфических линейных ПЦР-продуктов, кодирующих SPA-метку и селективный маркер, которые интегрируются и экспрессируются в одной рамке считывания в качестве карбокситерминальных слияний на фоне ddy 3, 3 0 с использованием системы рекомбинации бактериофага лямбда; на втором этапе проводится двухступенчатая очистка с использованием ковмодлина и аффинных бусин Anti-Flag для эффективного выделения малораспространенных белковых комплексов. Затем связанные белки, элюированные ковмодлином, элюирующим буфером или CEB, подвергаются перевариванию трипсином и анализируются методом масс-спектрометрии для идентификации белков.

Полученные результаты показывают, что несколько субъединиц основного фермента РНК-полимеразы, включая факторы терминации и антитерминации транскрипции, эффективно ко-очищаются с меченым белком субъединицы D РНК-полимеразы, что свидетельствует о возможности эффективного выявления новых ассоциированных компонентов с помощью данного подхода. Как правило, лица, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями при проведении двухэтапной аффинной очистки, где для успешного и эффективного извлечения комплексов с низкой и высокой степенью содержания из крупномасштабных культур абсолютно необходима тщательная обработка клеточных лизатов с использованием соответствующих буферных растворов. Процедуры аффинной очистки и масс-спектрометрии продемонстрируют Ольга Каган и ХБО Го, два техника моей лаборатории. Данный протокол начинается с нацеливания специфических амплифицированных последовательностей в штамм DDY330, в котором экспрессируется механизм рекомбинации Lambda red, как описано в письменном протоколе.

Затем штамм бактерий, экспрессирующий систему рекомбинации фага Lambda, культивируют в течение ночи в двух миллилитрах среды Луриа-Бертони или LB при 32 °C и перемешивании при 180 RPM. На следующий день один миллилитр ночной культуры инокулируют в 70 миллилитров свежей среды LB в коническом флаконе объемом 500 миллилитров. Инокулят выращивают при 32 °C и перемешивании при 180 RPM до достижения значения OD 600 примерно 0,8. Индукцию клеток осуществляют путем инкубации флакона в водяной бане при 42 °C при осторожном перемешивании при 180 RPM в течение 15 минут.

Сразу после индукции инкубируйте колбу в водяной бане с ледяной смесью в течение не менее 30 минут при встряхивании. После сбора и промывки клеток, как описано в письменной процедуре, ресуспендируйте осадок клеток в 700 µL ледяной стерильной воды, чтобы получить электрокомпетентные клетки для электропорирования. Внесите 1 µL очищенного ампликона в 40 µL электрокомпетентных клеток.

После гомологичной рекомбинации и интеграции клетки подвергают электропорации. Трансформанты, в хромосомы которых успешно рекомбинировала кассета с меткой, отбирают по устойчивости к канамицину. Несколько трансформантов выбирают для вестерн-блоттинга с целью подтверждения правильного образования слитых белков с SPA-меткой, используя антитела Anti-Flag M2, специфичные к Flag-эпитопам SPA-метки. Перенесите 10 мл ночной культуры в четырехлитровую колбу с 990 мл свежей среды TB, дополненной канамицином в концентрации 25 мкг/мл.

Культивируйте культуру при 32 °C при постоянном перемешивании со скоростью 250 RPM в течение пяти-шести часов, пока значение OD 600 не достигнет диапазона от двух до трех. Перенесите один литр культуры e coli SPA tag в чистые центрифужные флаконы и центрифугируйте клетки при 4 °C с ускорением 3,993 ×g в течение 15 минут. Затем ресуспендируйте клетки, как описано в письменном протоколе.

Перенесите образцы в стерильный стакан из нержавеющей стали, помещенный на лед, для проведения соникации. Погрузите зонд в образец и подвергайте соникации в течение трех минут. После соникации дайте образцу остыть в течение двух минут, чтобы избежать перегрева, перед центрифугированием сониката лизата.

Осторожно перенесите супернатант S из центрифужной пробирки в 50-миллилитровый полипропиленовый фалькон. Заморозьте образец с помощью жидкого азота и храните замороженный соницированный экстракт клеток в течение максимум шести месяцев при температуре -80 °C для последующего использования. Чтобы начать аффинную очистку замороженного соницированного экстракта клеток, поместите пробирку в холодную воду и инкубируйте экстракт клеток TH с 3 µl бензонауклеазы в течение 30 минут при 4 °C.

К этой смеси добавьте неионогенный детергент Triton X 100 и 200 µL суспензии сорбента Anti-Flag M2 agarose beads. Осторожно перемешайте содержимое, вращая пробирку в течение трех часов при температуре 4 °C. По истечении трех часов центрифугируйте пробирку при 1 700 ×g в течение шести минут. После центрифугирования аккуратно удалите как можно больше супернатанта, стараясь не задеть рыхлый осадок.

Ресуспендируйте осадок в оставшемся SNA, затем перенесите его в полипропиленовую подготовительную колонку. Извлеките нижние выпускные пробки колонки, чтобы элюат мог стекать под действием силы тяжести. Затем пять раз промойте колонку 200 µL 1× буфера FC и приступите к расщеплению с помощью TEV, как описано в письменном протоколе.

После расщепления плотно закройте колонку сверху и снизу. Осторожно перемешайте содержимое колонки, вращая ее в течение ночи при температуре 4 °C. Слейте элюат в новую колонку, сняв верхнюю крышку и нижнюю заглушку.

Промойте старую колонку 400 µL 1x буфера для связывания Cal Modlin и 150 µL суспензии бусин для связывания Cal Modlin. Элюируйте связанный белок четырьмя фракциями по 50 µL в новую пробирку типа eend orph, используя 1x элюирующий буфер Cal Modlin.

Распределите элюированную фракцию равными объемами в две чистые центрифужные пробирки типа eend orph. Затем высушите содержимое обеих пробирок с помощью вакуум-концентратора. Высушенный элюат из одной пробирки используют для проведения электрофореза с окрашиванием серебром, как описано в тексте, а вторую хранят при температуре -80 °C.

Для последующего использования в масс-спектрометрии к высушенному образцу добавьте 50 µL буфера для переваривания и 0,9 µL 100 mM трис-фосфина гидрохлорида; инкубируйте смесь в течение 45 минут при комнатной температуре для проведения стадии восстановления. Затем добавьте 1 µL 500 mM IDO ацетамида и инкубируйте в темноте еще 40 минут для алкилирования образца. После второго раунда инкубации добавьте в смесь 1 µg трипсина. Инкубируйте образец либо при 37 °C в течение пяти часов, либо в течение ночи при комнатной температуре после инкубации.

Обязательно остановите реакцию, добавив 1 µL уксусной кислоты. Затем подготовьте Millipore zip tip (конус для пипетирования), как описано в тексте, для эффективного связывания пептида с наконечником. Перемешайте смесь пептидов 20 раз, затем удалите несвязавшуюся смесь пептидов с наконечника путем аспирации и дозирования промывочного раствора.

Повторите эту процедуру дважды для эффективного связывания смеси пептидов с наконечником, используя наконечник со связанным пептидом. Аспирируйте 10 µL увлажняющего и эквилибрирующего раствора и перенесите в чистую микроцентрифужную пробирку. Повторите этот шаг дважды.

После высушивания элюированных образцов в вакуум-концентраторе образцы можно подвергнуть немедленному анализу методом масс-спектрометрии или хранить при температуре -80 °C до момента использования. Микроколонки, используемые в данной процедуре, заполнены примерно 10 сантиметрами смолы lunar C 18 с размером частиц 3 мкм и соединены с источником наноэлектрораспылительной ионизации ProZion, установленным в линию с прибором Orbitrap. Для обеспечения стабильной скорости потока на кончике около 300 нл/мин во время разделения пептидов используется бинарный нанопотоковый ВЭЖХ-насос ProZion; для достижения необходимого разбавления пептидов установите градиент органического буфера в соответствии со сложностью образца.

Для данного образца SPA из e coli подвижная фаза состояла из растворителя A (95% вода для ВЭЖХ и 5% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислоты) и растворителя B (5% вода для ВЭЖХ и 95% ацетонитрила с 0,1% муравьиной кислоты). После масс-спектрометрии спектры были проанализированы с помощью алгоритма поиска по базе данных, такого как SEQuest, по базе последовательностей белков e coli. Результаты были статистически отфильтрованы с помощью вероятностного алгоритма, такого как StarQuest, для обеспечения низкого уровня ложноположительных результатов. Было установлено, что и меченная SPA РНК-полимеразная сигма-фактор, и белок YakL с неизвестной функцией специфически ко-очищались с основным ферментом РНК-полимеразы, включая субъединицы альфа, бета и бета-штрих, а также с фактором рециклирования РНК-полимеразы. В отличие от меченного сигма-фактора РНК-полимеразы, YakL дополнительно связывался с основным фактором антитерминации терминации транскрипции, что указывает на специализированную функцию в процессе транскрипции.

Методом ЖХ-МС было обнаружено несколько других более мелких соочищающихся белков, которые не были заметны на геле, включая Омега-субъединицу РНК-полимеразы, факторы терминации и определения транскрипции, а также USA и NUSD. Напротив, в независимом эксперименте белки аппарата мобилизации серы с метками S-U-F-B-S-U-F-C и SUFD соочищались друг с другом, что указывает на их совместное участие в биосинтезе железосерных кластеров в составе единого скаффолд-комплекса. Этот репрезентативный пример подчеркивает тот факт, что ранее хорошо изученные, детально аннотированные бактериальные мультибелковые комплексы, участвующие в жизненно важных биологических процессах, часто имеют новые ассоциированные компоненты, которые могут быть эффективно идентифицированы.

При использовании данного подхода низкое число копий белка SUFB могло привести к слабой интенсивности сигнала по сравнению с высокой интенсивностью, наблюдавшейся в экспериментах по осаждению SUFC и SUFD. Для определения состава стабильных многобелковых комплексов взаимодействиям с высокой степенью достоверности присваивались баллы совместного очищения с учетом уникальности отношений «приманка-мишень», «приманка-приманка» и «мишень-мишень». Затем, используя процедуры кластеризации графов, такие как алгоритм марковской кластеризации, из разделенной вероятностной сети белок-белковых взаимодействий (PPI) идентифицировались дискретные белковые кластеры.

Предполагаемые сети взаимодействий могут быть визуализированы с помощью Cytoscape. Сочетание протеомных данных с дополнительными доказательствами функциональных ассоциаций, полученными методами геномики, может быть использовано для изучения новых механистических ролей ранее аннотированных белков e coli. В данной работе для e coli были определены подсети белковых комплексов и функциональных модулей, которые участвуют в формировании более широких функциональных окружений.

Основной иерархический кластер Грэма демонстрирует закономерности функциональных прогнозов и существующих аннотаций для функционально сиротских и охарактеризованных генов E. coli; желтый и синий цвета представляют существующие и предполагаемые функции соответственно, а интенсивность оттенков отражает показатели достоверности. Биологические процессы, связанные с различными соседствами, указаны справа; на врезках показаны отдельные компоненты репрезентативного соседства на основе интегрированных показателей сходства сетей физических и функциональных взаимодействий. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как можно изолировать стабильные белковые комплексы E. coli, используя метод аффинной очистки в сочетании с масс-спектрометрией.

В принципе, данный метод может быть применен для характеристики мембранных белковых комплексов или белковых комплексов любого другого вида, для которого возможна рекомбинация.