Стандартизированные Подготовка одноклеточных суспензий от мыши легочной ткани использованием gentleMACS диссоциатор
2 июля 2009 г.
Диссоциирующего клетки определенных типов ткани требует специфических параметров для агитации ткани для получения большого количества жизнеспособных, culturable клеток. Miltenyi gentleMACS диссоциатор оптимизирует эту задачу с простым, практичным протокола. В этой публикации использование этого аппарата на легочной ткани объясняется.
В данном видеопротоколе вы увидите, как диссоциировать ткань легких взрослых мышей с использованием метода gentle max. После диссоциации легочной ткани в присутствии коллагеназы D и ДНКазы I полученные суспензии из отдельных клеток фильтруют через клеточный фильтр с порами 70 мкм, центрифугируют и ресуспендируют для дальнейшего использования. Здравствуйте, я Мелани Млу из компании Mil Biotech, Германия.
Сегодня я продемонстрирую вам воспроизводимую и автоматизированную процедуру приготовления суспензии единичных клеток из ткани легкого мыши с использованием системы диссоциации GenX. В нашей лаборатории мы применяем этот метод для получения суспензий единичных клеток с целью выделения лейкоцитов или эндотелиальных клеток. Итак, приступим.
Перед началом выполнения протокола необходимо подготовить несколько стандартных растворов. Во-первых, потребуется буфер Хебса (Hebes). Во-вторых, раствор коллагеназы D, содержащий 100 mg/ml фермента в буфере Хебса.
В-третьих, раствор dase one, содержащий 20 000 единиц dase one на миллилитр. Наконец, два стандартных буферных раствора: типичный PBS-буфер с pH 7.2 и PEB-буфер, приготовленный на основе промывочного раствора AutoMax и стокового раствора BSA.
Мы начинаем выполнение протокола с препарированного легкого самки мыши для биопсии в возрасте от шести до семи недель. Убедитесь, что легкое очищено от прилегающих органов, таких как сердце и тимус, эфферентных и афферентных кровеносных сосудов, трахеи и соединительных тканей. Промойте ткань в чашке Петри с PBS для удаления эритроцитов.
Обычно легкое мыши в этом возрасте весит от 110 до 150 миллиграммов. Если вы планируете проводить диссоциацию легких более старых животных или мышей других линий, взвесьте ткань и буфер. В одной пробирке можно диссоциировать максимум 450 миллиграммов ткани.
Перенесите легочную ткань в трубку GentleMax C, содержащую 4,9 мл буфера HEBS. Добавьте к легочной ткани и буферу 100 мкл раствора коллагеназы D до конечной концентрации 2 мг/мл. Затем добавьте 10 мкл DNase.
Один раствор для более чем 150 миллиграммов ткани. Добавьте 20 µL раствора dase one. Убедитесь, что пробирка C плотно закрыта, и поместите ее вверх дном в gentle max dis.
Убедитесь, что ткань находится между ротором и статором. Выберите программу для легких и запустите ее, нажав кнопку старта; по окончании программы извлеките С-образную пробирку из прибора и инкубируйте образец в течение 30 минут.
Во время инкубации в термостате при 37 °C пробирку следует вращать с помощью ротатора Max Mix или вручную каждые пять минут. После инкубации верните пробирку C в gentleMax Tissue dissociator и запустите вторую программу для легких. Пока выполняется программа, подготовьте пробирку объемом 50 мл для сбора отфильтрованных клеток, заменив колпачок на ячейковый фильтр с размером пор 70 µm. После завершения программы диссоциации, в зависимости от распределения материала образца в пробирке, может потребоваться кратковременное центрифугирование для концентрирования образца.
Диссоциированные клетки можно извлечь из пробирки с помощью пипетирования через герметичную перегородку крышки пробирки C. С помощью подходящего наконечника дозатора объемом 1000 µL суспензию клеток переносят на клеточный фильтр (cell strainer) для удаления крупных частиц или агрегатов. После того как раствор стечет, промойте клеточный фильтр, добавив еще 5 mL буфера HBSS комнатной температуры, чтобы собрать отфильтрованные клетки в осадок.
Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при 300 GS в течение 10 минут. Затем аспирируйте супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок в нужном объеме буфера PEB комнатной температуры.
Не сливайте супернатант. Теперь можно переходить к последующим этапам анализа. Диссоциация ткани легкого мыши с использованием данной методики позволяет получить высокий процент жизнеспособных лейкоцитов и эндотелиальных клеток.
Полученные суспензии одиночных клеток окрашивали CD 45 PE, CD 1 46 FITC или CD 31 FITC и анализировали методом проточной цитометрии. На данном графике показано обогащение дендритными клетками с использованием микросфер CD 11 C, сепаратора minimax и двух колонок MS. Итак, я только что продемонстрировал вам standardized способ подготовки суспензий одиночных клеток из легочной ткани мыши с помощью системы GentleMACS и пробирок C.
Данный метод позволяет эффективно осуществлять диссоциацию тканей. При выполнении этой процедуры важно правильно препарировать легкое и обработать ткань сразу после извлечения. Полученные суспензии одиночных клеток можно использовать для дальнейших экспериментов.
Например, магнитная маркировка клеток с последующим выделением лейкоцитов или эндотелиальных клеток. На этом все. Спасибо за внимание и успехов в ваших экспериментах.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видеопротоколе демонстрируется метод диссоциации тканей легких взрослых мышей с использованием диссоциатора gentleMACS. Эта процедура разработана для получения большого количества жизнеспособных клеток, пригодных для культивирования и дальнейшего использования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Методы диссоциации клеток
- Приготовление суспензии одиночных клеток
- Анализ тканей легкого мыши
Теоретическая часть
- Диссоциация клеток из тканей требует соблюдения определенных параметров.
- Диссоциатор gentleMACS обеспечивает оптимизированный протокол.
- В процессе диссоциации используются коллагеназа D и DNase.
- Фильтрованные клеточные суспензии подготавливаются для дальнейшего применения.
Цель исследования
- Продемонстрировать воспроизводимый метод приготовления суспензий из отдельных клеток.
- Способствовать изучению лейкоцитов и эндотелиальных клеток.
- Представить практический протокол для исследователей в данной области.
Используемые методы
- Использование диссоциатора gentleMACS для перемешивания ткани.
- Применение коллагеназы D и ДНказы в процессе диссоциации.
- Фильтрация клеточных суспензий через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм.
- Центрифугирование и суспендирование клеток для дальнейшего использования.
Основные результаты
- Успешная диссоциация тканей легкого мыши до состояния суспензии одиночных клеток.
- Получение большого объема жизнеспособных cultured-клеток.
- Протокол продемонстрировал воспроизводимость и эффективность.
- Подготовленный материал подходит для последующих приложений.
Выводы
- Диссоциатор gentleMACS эффективен для диссоциации тканей легкого.
- Этот метод может быть применен к различным типам тканей.
- Данный метод представляет собой ценный инструмент для исследователей, изучающих ткани легкого.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Стандартизированная диссоциация тканей является критически важным предварительным этапом в исследованиях в области иммунологии и биологии сосудов, обеспечивающим воспроизводимую подготовку суспензий первичных клеток для последующего анализа. Диссоциатор gentleMACS обеспечивает автоматизированный, щадящий и масштабируемый метод получения суспензий одиночных клеток с высокой жизнеспособностью из тканей легкого мыши, обеспечивая стабильный исходный материал для проточной цитометрии, сортинга клеток и молекулярного профилирования. Эта возможность повышает достоверность прогнозов в исследованиях по валидации мишеней за счет снижения вариабельности выхода и жизнеспособности клеток в различных экспериментах.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать популяции лейкоцитов и эндотелиальных клеток в легочной ткани для проверки целевых гипотез.
- Практическая ценность: снижает вариативность ручной обработки тканей, повышая воспроизводимость результатов в разных лабораториях и в разные временные промежутки.
- Прогностическая ценность: обеспечивает стабильный ввод клеточного материала для проточной цитометрии и сортировки, что повышает достоверность результатов фенотипического скрининга.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать отфильтрованные суспензии без клеточного детрита, подходящие для окрашивания антителами и проведения проточных анализов.
- Практическая ценность: стандартизированное ферментативное переваривание и механическая диссоциация обеспечивают воспроизводимость выхода клеток от серии к серии.
- Готовность к анализу: позволяет создавать суспензии, совместимые с последующими этапами, такими как магнитное мечение и сепарация клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Обеспечивает релевантную для заболевания систему изучения динамики иммунных и сосудистых клеток в легочной ткани.
- Поддержка доклинических моделей: Позволяет изолировать первичные клетки из легких мышей для механистического снижения рисков при определении терапевтических мишеней.
- Прогресс с учетом рисков: Надежная подготовка клеток обеспечивает стабильный анализ биомаркеров и функциональную валидацию в рамках доклинических рабочих процессов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Диссоциатор gentleMACS встраивается в рабочий процесс исследования в качестве стандартизированного этапа подготовки образцов между забором ткани и клеточным анализом, обеспечивая надежный переход от ткани ex vivo к отдельным клеткам, готовым к анализу.
- Открытия в биологии: Обеспечивает выделение иммунных и стромальных клеток легких на основе гипотез для анализа сигнальных путей.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые клеточные суспензии для высокопроизводительного или проточного фенотипического скрининга иммуномодуляторов.
- Аналитика: Обеспечивает количественную оценку методом проточной цитометрии (например, CD45+, CD31+) для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: Связывает модели легких мышей с исследованиями иммунных и эндотелиальных клеток человека посредством стандартизированной подготовки.
- Корпоративное повторное использование: Предустановленный протокол для легких в приборе позволяет использовать его в различных проектах по изучению воспаления, фиброза или инфекций легких.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Высокая жизнеспособность и чистота лейкоцитов и эндотелиальных клеток повышают качество данных в последующих приложениях.
- Операционная ценность: Автоматизация сокращает время непосредственной работы и вариативность диссоциации тканей, зависящую от пользователя.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) на основе стабильных показателей выхода и жизнеспособности клеток.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию мишеней с учетом рисков, обеспечивая надежный ввод первичных клеток для валидации.
Особенности реализации
- Требуется подготовка в области асептического препарирования тканей и работы с ферментами.
- Зависит от наличия диссоциатора gentleMACS с программой для легких и соответствующих С-пробирок.
- Необходимо стандартизировать концентрации ферментов (коллагеназы D, ДНКазы) и условия буфера для всех пользователей.
- Может потребоваться адаптация протокола для различных линий мышей, возраста или моделей заболеваний, влияющих на плотность ткани.
- Метод ограничен тканями, совместимыми с ферментативной диссоциацией; для фиброзных или кальцинированных образцов могут потребоваться альтернативные механические методы.
