Производство лентивирус

Данная процедура начинается с трансфекции клеток 293T лентивирусом, плазмидой и векторами упаковки вируса; супернатант вируса собирают после периода инкубации не менее 48 часов. Супернатант фильтруют, а затем концентрируют с помощью ультрацентрифуги. Вирусный осадок ресуспендируют в PBS для определения титра вируса; сначала концентрированный вирус разводят в полной среде, затем проводят серию разведений для инфицирования клеток лентивирусом.

Здравствуйте, меня зовут Шейн Вонг, я работаю в лаборатории Майкла Макмануса в Центре диабета Калифорнийского университета в Сан-Франциско. Я — Майкл Макманус. Сегодня мы продемонстрируем вам методику получения лентивирусов.

Мы используем данную процедуру в лаборатории для создания лентивирусов для РНК-интерференции. Итак, приступим. Для начала выполнения данного протокола подготовьте ДНК, которой будут трансфицированы клетки 2 9 3 T.

Сначала разведите реагент для трансфекции FU gene six в пробирке объемом 1,5 мл, смешав 30 µL Fuji six с 600 µL бессывороточной среды. Будьте осторожны, чтобы Fuji не касался стенок пробирки при добавлении в среду; инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем в крышке пробирки смешайте 4 µg лентивирусной плазмиды с 1,33 µg.

Каждый представляет собой вирусный упаковочный вектор третьего поколения. Лентивирусная плазмида содержит ДНК. Вирус встраивается в геном каждой инфицированной клетки, в то время как упаковочные векторы содержат гены всех остальных белков, необходимых для создания лентивируса; закройте крышку и перемешайте, несколько раз перевернув пробирку.

Инкубируйте ДНК и реагент для трансфекции в течение 15–20 минут при комнатной температуре. Теперь переходите к трансфекции клеток 293 подготовленной ДНК; используйте клетки, высеянные за 24 часа до этого и достигшие 50–70% конфлюэнтности. В ламинарном шкафу для культур тканей перенесите всю подготовленную ДНК на планшет с клетками 293. Осторожно перемешайте содержимое, аккуратно наклоняя планшет вперед и назад. Верните клетки в инкубатор и оставьте их для производства вируса на 48–96 часов до момента сбора. Во время инкубации клетки 293 вырабатывают лентивирусы, геномы которых содержат РНК-копию интересующей вас ДНК.

Теперь пришло время собрать вирус. Достаньте клетки из инкубатора. В шкафу для работы с культурами тканей подготовьте шприцевой фильтр с порами 0,4 или 5 мкм, одноразовый шприц объемом 10 мл и центрифужную пробирку UltraClear от Beckman.

Используйте одноразовый шприц, чтобы удалить супернатант, содержащий вирус. Присоедините к наконечнику шприцевой фильтр с размером пор 0,45 micron и профильтруйте вирус в центрифужную пробирку UltraClear Beckman. Фильтр пропускает только вирусы, задерживая клетки; после этого утилизируйте все клетки, продуцирующие вирус, путем инкубации.

Чашки для культивирования, шприцы и фильтры выдерживают в 10% растворе гипохлорита натрия в течение 45 минут. После сбора и фильтрации вируса необходимо провести его концентрирование методом ультрацентрифугирования. Используйте DMEM без сыворотки для выравнивания массы всех пробирок с вирусом с точностью до 0,2 г.

Затем поместите сбалансированные центрифужные пробирки в стаканы ротора SW 41 TI или SW 28. Плотно закройте стаканы ротора и закрепите их на роторе. После этого установите ротор в ультрацентрифугу.

Центрифугируйте вирус в течение примерно 90 минут при температуре 4 °C со скоростью 25 000 об/мин в роторе SW 41 TI или 24 000 об/мин в роторе SW 28. После центрифугирования вернитесь к ламинарному шкафу для культуры тканей и переверните пробирку, чтобы слить супернатант в контейнер с 10% раствором гипохлорита натрия. Используйте салфетку Kimwipe, чтобы удалить излишки жидкости вокруг осадка, и поместите пробирку в перевернутом виде в подходящий штатив не более чем на пять минут, пока вы не будете готовы ресуспендировать осадок.

Для ресуспендирования вирусного осадка с помощью фильтрующего наконечника добавьте в пробирку 100 µL стерильного предварительно отфильтрованного PBS. Затем выполните пипетирование вверх-вниз примерно 20 раз. Оставьте вирус при температуре 4 °C на ночь для полного ресуспендирования.

Вирусные препараты можно хранить при температуре 4 °C около одной недели и при -80 °C до одного года. Не забудьте обработать все пустые пробирки 10%-ным раствором гипохлорита натрия перед утилизацией. Если вы планируете использовать вирусный препарат дольше одной недели, его следует хранить в холодильнике.

Приготовьте минимальные аликвоты объемом от 5 до 20 µL для будущих экспериментов и одну аликвоту объемом от 3 до 5 µL для определения титра; заморозьте и храните аликвоты при температуре приблизительно -80 °C. Следующим шагом является определение вирусного титра. Если в вашу лентивирусную плазмиду был включен ген флуоресцентного репортера, инфицированные клетки будут флуоресцировать, и вы сможете определить вирусный титр с помощью проточной цитометрии.

Для начала разведите три µL концентрированного вируса в 1,5 мл полной среды в лунках с первой по шестую в одном ряду 96-луночного планшета. Выполните следующие серийные разведения во всех шести лунках, используя по 100 µL полной среды DMEM. В первую лунку добавьте 100 µL среды без вируса.

Это ваш неокрашенный контроль. Во вторую лунку добавьте 100 µL разведенного вируса. В третью лунку добавьте 100 µL смеси из второй лунки, а затем в четвертую.

Добавьте 100 µL из третьей лунки в пятую. Добавьте 100 µL из четвертой лунки в шестую. Добавьте 100 µL из пятой.

В завершение из шестой лунки удалите 100 µL и утилизируйте их с использованием отбеливателя; затем доведите общий объем во всех лунках до 200 µL с помощью DMEM. С каждым разведением концентрация вируса уменьшается вдвое. Обратите внимание, что данные разведения являются рекомендуемыми и должны быть эффективны для титрования большинства концентрированных вирусов.

Если титр вашего вируса низок или образец не концентрирован, может потребоваться корректировка разведений. Перед утилизацией в контейнер для биоопасных отходов обработайте весь неиспользованный разведенный вирус 10% раствором гипохлорита натрия в течение 45 минут. Добавьте примерно 15 000 здоровых активно делящихся T-клеток 2 9 3 в каждую из шести лунок.

Для определения титра 16 вирусных препаратов можно использовать один 96-луночный планшет: доведите объем в лунках до 200 µL, верните клетки в инкубатор и оставьте их для инфицирования минимум на 48 часов. После инкубации проанализируйте флуоресценцию клеток с помощью проточного цитометра. Процент флуоресцентных клеток в каждой лунке можно использовать для определения титра или количества инфекционных вирусных частиц на миллилитр добавленного вируса.

При интерпретации результатов проточной цитометрии рассчитайте количество инфекционных единиц на миллилитр по следующей формуле. Обратите внимание, что точный расчет титра возможен только в том случае, если в инфицированные клетки произошло не более одной вирусной интеграции на клетку.

Чтобы гарантировать соблюдение этого условия, для расчетов следует использовать клетки с уровнем инфицирования менее 15%. В клетках с более высоким уровнем инфицирования, скорее всего, произошло многократное интегрирование вируса в одну клетку. Разведение, предложенное на втором этапе, должно обеспечить получение нескольких образцов с уровнем инфицирования в этом диапазоне.

В идеале следует использовать несколько образцов для построения графика титрования, на основании которого можно рассчитать окончательный титр. Для расчета вирусного титра можно использовать формулу, полученную по аппроксимирующей линейной прямой, однако при необходимости титр можно рассчитать и по одному образцу. Ожидаемый титр для неконцентрированного вируса составляет 1 × 10⁷ трансдуцирующих единиц на миллилитр, а для концентрированного вируса — 1 × 10⁸ трансдуцирующих единиц на миллилитр.

Мы только что продемонстрировали вам способ получения лентивирусов при выполнении данной процедуры. Важно соблюдать все правила биобезопасности и надлежащим образом утилизировать отходы. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.