Упаковка с ВИЧ или FIV основе Lentivector Конструкции выражения и трансдукции VSV-G Pseudotyped вирусных частиц

Общая цель данной процедуры — изучение процесса упаковки лентивирусов. Протокол рассчитан на пять дней. В первый день клетки-продуценты 293TN высевают с рассчитанной плотностью.

На второй день клетки трансфицируют выбранной лентивирусной векторной конструкцией, содержащей целевой ген, и смесью плазмид для упаковки вируса. На четвертый день вирусный супернатант собирают и концентрируют путем добавления раствора для осаждения вирусов PEG. Заключительные этапы процедуры включают сбор сконцентрированного с помощью PEG вируса, разделение его на аликвоты и заражение клеток сконцентрированным вирусом для определения вирусного титра.

В конечном итоге количественная ПЦР стабильно интегрированных генов используется для расчета количества стабильно интегрированных конструктов. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими способами, такими как трансфекция плазмидами или ретровирусная трансдукция, является то, что оптимизированный протокол упаковки лентивируса от FBI позволяет получать функционально активный вирус с высоким титром, что обеспечивает эффективную доставку практически в любую клетку млекопитающих, включая труднотрансфицируемые клетки, такие как стволовые клетки и неделящиеся первичные клетки. Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями из-за незнания мелких деталей протокола, которые имеют решающее значение для успешного получения вируса с высоким титром.

Визуальная демонстрация данного метода полезна, поскольку плотность клеток, определяемая под микроскопом во время трансфекции, влияет на эффективность упаковки вируса, что, в свою очередь, определяет итоговый вирусный титр. В соответствующих случаях экспрессия флуоресцентного репортера позволяет оценить эффективность трансфекции, которая оказывает значительное влияние на конечный вирусный титр. Кроме того, визуальная демонстрация этого метода помогает исследователям ознакомиться с малозаметными, но важными аспектами протокола, такими как оптимальные способы поддержания стерильности на протяжении всего процесса и методы предотвращения попадания клеточного дебриса в собираемый вирус.

Эффективный лентивирусный упаковочный процесс опирается на три компонента. Во-первых, лентивирусный экспрессионный вектор должен содержать ряд элементов, необходимых для упаковки вируса и стабильной интеграции, а также элементы для экспрессии целевого гена: короткую шпилечную РНК, микроРНК или репортерную кассету.

Во-вторых, лентивирусные упаковочные плазмиды должны обеспечивать синтез белков, необходимых для упаковки РНК-копии экспрессионной конструкции в рекомбинантные псевдовирусные частицы, а также для последующей обратной транскрипции и интеграции вируса при инфицировании. В-третьих, клетки-продуценты 293 TN должны быть подвергнуты транзиентной котрансфекции экспрессионными и упаковочными векторами. Эти клетки вырабатывают псевдовирусные частицы с высоким титром, которые затем собирают из культуральной среды.

В конечном итоге успешная трансдукция целевых клеток в основном зависит от количества вирусных частиц на одну клетку для данного типа клеток. Иными словами, от множественности заражения. Начните с культивирования клеток 293T в чашках для культивирования клеток диаметром 15 сантиметров в течение 18–24 часов до достижения 60–80% конфлюэнтности.

На момент трансфекции с каждой планшета будет получено примерно 14 миллионов клеток для увеличения выхода вируса. На следующий день можно использовать более одного планшета; когда клетки 2 9 3 TN достигают 60–80% конфлюэнтности, они готовы к трансфекции. Для каждого планшета с клетками добавьте 1.6 milliliters безсывороточной среды DMEM в 15 milliliter пробирку Falcon.

Затем добавьте 22.5 µg ppac H one или Ppac F1 и 4.5 µg вашего лентивирусного векторного конструкта в DMEM и перемешайте, несколько раз прокачав жидкость через пипетку. Далее добавьте 55 µl чистого affection в ту же пробирку и перемешайте на вортексе в течение 10 секунд, после чего инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. Через 15 минут внесите содержимое пробирки в каждую культуральную чашку.

Добавляйте по каплям, затем осторожно перемешайте планшет круговыми движениями и инкубируйте клетки в течение 48 часов при 37 °C в атмосфере 5% CO2. По истечении 48 часов, если конструкция лентивирусного вектора экспрессирует флуоресцентный ген, такой как GFP, осмотрите клетки под микроскопом; при успешной трансфекции от 50% до более чем 90% клеток будут проявлять зеленую флуоресценцию. Теперь соберите супернатант клеточной культуры в коническую пробирку объемом 50 мл. Супернатант содержит инфекционные псевдовирусные частицы.

Попадание отдельных клеток при снятии с планшета не окажет негативного влияния на продукцию вируса. Для удаления клеточного дебриса центрифугируйте вирусный супернатант при 1500 G в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем, не затрагивая осадок, соберите вирусный супернатант, оставив слой объемом около 500 µL, и переходите к следующему этапу — концентрированию вирусных частиц через 72 часа после трансфекции.

Дополнительный второй сбор вирусного супернатанта может быть выполнен с использованием той же методики после сбора вирусного титра. Концентрирование проводят путем добавления одного объема ледяного раствора ПЭГ для осаждения вирусов на каждые четыре объема супернатанта в полипропиленовой центрифужной пробирке объемом 50 мл. Переверните пробирку с раствором для перемешивания.

Никогда не используйте вортекс, затем храните раствор без перемешивания при температуре 4 °C в течение до 96 часов. После охлаждения в течение минимум 12 часов центрифугируйте смесь при 1500 G в течение 30 минут при температуре 4 °C. После центрифугирования осажденные с помощью PEG лентивирусные частицы будут выглядеть в виде бежевого или белого осадка на дне пробирки.

Теперь осторожно удалите остатки жидкости путем аспирации, стараясь не потревожить осадок с преципитированными лентивирусными частицами. В качестве альтернативы удалите большую часть супернатанта и ресуспендируйте осадок в оставшемся супернатанте. Затем перенесите суспензию в стерильную пробирку типа Эппендорф объемом 2 мл и центрифугируйте ее в охлаждаемой микроцентрифуге в течение двух минут.

При 14 000 RPM отпипетируйте оставшийся супернатант и ресуспендируйте осадок лентивирусных частиц в ледяном стерильном буфере в объеме от 1/10 до 1/100 от исходного объема. Осторожно перенесите осадок в раствор с помощью пипетки, избегая образования пузырьков и постоянно поддерживая низкую температуру. Убедитесь, что осадок полностью ресуспендирован.

Наконец, разлейте чернила аликвотами по 15–25 µL в стерильные криопробирки на льду и храните пробирки при температуре -70 °C. Успешный цикл упаковки обеспечит получение от 10 миллионов до 1000 миллионов IFU на мл для трансдукции вируса в 24-луночный культуральный планшет; при этом в каждую лунку следует посеять по 50 000 клеток и культивировать их в течение ночи в заданных условиях. Для целей титрования при трансдукции конфлюэнтность клеток должна составлять от 50 до 70%.

Клетки HT 1080 можно использовать в качестве контрольной клеточной линии, легко поддающейся трансдукции. На следующий день аспирируйте среду из лунок с клетками. Затем смешайте культуральную среду с концентрированным раствором трансдукционных векторов так, чтобы конечная концентрация трансдукционных векторов составляла 1×. Добавьте по 0,5 мл трансдуцированного раствора в каждую лунку с клетками-мишенями при соответствующей плотности конфлюэнтности от 50% до 70%. Добавьте вирус в каждую лунку в следующих разведениях: 1:100, 1:10 и в прямом разведении 1:1.

Вирус может оставаться в контакте с клетками-мишенями до 72 часов без замены среды. Через 72 часа провирус стабильно интегрируется в геном хозяина и начнет экспрессировать целевой ген. Если экспрессия имеющегося флуоресцентного маркера позволяет оценить эффективность трансдукции при различных разведениях вируса, то количество инфекционных единиц можно количественно определить с помощью QPCR.

После определения титра вируса рассчитайте необходимый объем вируса для достижения требуемой множественности заражения (MOI) для других целевых клеток. Измерение титра и контроль MOI обеспечивают воспроизводимость результатов между отдельными экспериментами и различными партиями вирусных препаратов. Теперь вирус готов к использованию в дальнейших исследованиях.

Исходная плотность клеток 2 9 3 TN имела решающее значение для успешной упаковки вируса в день трансфекции. Степень конфлюэнтности этих клеток 2 9 3 TN составляла от 60 до 80%. Было установлено, что через 24 часа после успешной трансфекции лентивирусным вектором, экспрессирующим GFP, по крайней мере 90% клеток 2 9 3 TN проявляли зеленую флуоресценцию.

Через 72 часа после трансдукции в клетках-хозяевах HT 10 80 продолжалась экспрессия GFP. Это указывает на то, что лентивирусная конструкция стабильно интегрировалась в геном хозяина; при этом трансдукция тех же клеток-хозяев в десятикратном разведении привела к пропорциональному снижению экспрессии GFP, поскольку зависимость между вирусным титром и лентивирус-опосредованной экспрессией генов является прямо пропорциональной.

После освоения данной методики ее выполнение при соблюдении всех правил занимает около пяти дней по один-два часа в день. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как эффективно и безопасно упаковывать функционально инфекционные вирусные частицы и успешно трансдуцировать клетки вирусом. Не забывайте, что работа с лентивирусом может быть опасной и требует соблюдения мер предосторожности, таких как работа в боксе для культур тканей уровня BSL-2.

При выполнении данной процедуры необходимо всегда использовать лабораторный халат и перчатки.