Мезоскопические флуоресцентная томография для В естественных условиях Изображений развивающихся Drosophila

Для проведения реконструкции развивающихся органов Drosophila melanogaster необходимо определить прямую модель, которая наилучшим образом описывает распространение света внутри самой куколки. Процедура начинается с выбора белой прекуколки и приклеивания её к концу капиллярной трубки таким образом, чтобы переднезадняя ось куколки была ориентирована параллельно трубке. Небольшая капиллярная трубка заполняется флуоресцентным красителем и вводится в оболочку куколки.

После тщательной настройки осей куколку поворачивают на 360 градусов. Снимки делают под разными углами. Полученные данные флуоресцентного транс-освещения используются для построения прямой модели, которая будет применяться для визуализации развития органа.

Здравствуйте, меня зовут Клаудия, я работаю в Центре вспомогательной биологии (Center for Assistance Biology) в Массачусетском госпитале общего профиля Гарвардской медицинской школы. Я Ула Петоу из лаборатории Парамонта (Paramount Lab) Гарвардской медицинской школы. А я Даниэль Розански из Института биологической и медицинской визуализации Мюнхенского технического университета и центра Хеллимана в Мюнхене. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру трехмерной реконструкции всего тела *Oph. melano casta*.

В нашей лаборатории мы используем данную процедуру для визуализации развивающихся органов in vivo в процессе их формирования. Итак, приступим. Перед началом работы, пожалуйста, обратите внимание, что этому ролику предшествует сопроводительное видео, в котором некоторые технические аспекты оптической проекционной томографии объяснены более детально, чем здесь.

Кроме того, в другом видео объясняются принципы визуализации подготовленных тканей или органов более крупных животных. Во всех экспериментах, описанных в данном видео, будут использоваться трансгены drosohpila. Это EL A gal four, экспрессируемый в слюнных железах, apteris gal four, который экспрессируется в личиночных тканях-предшественниках крыла и груди взрослой особи, а также трансген, кодирующий флуоресцентный белок.

Для получения тканеспецифичной экспрессии GFP самцов-контролей, не флуоресцирующих и несущих трансгены UAS, линии gal four называемые U-A-S-G-F-P и white 1118, скрещивают с девственными самками, несущими трансгены GAL four. Скрещивания проводят, используя от 8 до 10 девственных самок и самцов на стандартной среде для мух с добавлением пекарских дрожжей. Пробирки содержат при температуре 25 °C в увлажненном инкубаторе при 12-часовом цикле свет/темнота.

Через два дня после начала скрещивания родителей переносят в новый флакон; спустя пять-шесть дней в флаконе начнут появляться белые личинки PUI. Отбор особей с экспрессией GFP проводят с помощью флуоресцентного dissecting-микроскопа. Выбор белых личинок PUI гарантирует правильное определение стадии развития животных, так как они остаются белыми в течение примерно одного часа.

После окукливания они приобретают пигментацию или коричневатый цвет. Куколки, экспрессирующие GFP, аккуратно собирают из пробирок с помощью влажной кисти и помещают в каплю воды или PBS в чашку Петри, при этом их необходимо очистить от автофлуоресцентных материалов. После этого, используя кисть, их подготавливают к томографической визуализации.

Если PrepU требуется дальнейшее созревание для достижения нужной стадии развития, их можно оставить в чашке Петри с влажным бумажным полотенцем или в чистом флаконе для проб. Это обеспечит достаточную влажность и правильное развитие для последующей визуализации. PrepU должен быть зафиксирован на внутренней стенке стеклянной капиллярной трубки диаметром 800 микрон.

Нанесите суперклей на задний конец куколки; поместите заклеенную поверхность прекуколки в трубку так, чтобы передне-задняя ось мухи была параллельна трубке. Передняя часть насекомого будет выступать за пределы капиллярной трубки. Теперь зафиксируйте капиллярную трубку на поворотном столике микроскопа.

В вертикальном положении отрегулируйте ось наклона поворотного столика так, чтобы ось вращения пробирки была параллельна столбцам пикселей ПЗС-матрицы камеры. После уточнения положения мухи приступите к получению изображений. В данном примере будут визуализированы животные с флуоресцентными слюнными железами; особи, экспрессирующие GFP в слюнных железах, могут быть получены путем скрещивания линий EAG four и U-A-S-G-F-P.

Мы начинаем с закрепленной препупы: освещаем ее возбуждающим лучом и регистрируем флуоресцентный сигнал GFP. В режиме транслюминесценции поворачиваем препупу на 360 градусов вокруг ее вертикальной оси и получаем изображения при транслюминесценции. Каждое изображение соответствует 10 градусам поворота.

Общее время сбора данных зависит от уровня флуоресценции и интенсивности возбуждающего пучка. Типичное время составляет порядка одной минуты. В данном примере будет проведена визуализация куколки DSO, экспрессирующей GFP в имагинальных дисках крыльев.

Эту куколку можно получить из флакона с потомством от скрещивания линий Aus GAL four и U-A-S-G-F-P. Прекуколку монтируют, как было описано ранее. Однако, поскольку время визуализации в данном эксперименте составляет около восьми часов, крайне важно, чтобы среда оставалась влажной и поддерживалась при комнатной температуре. Чтобы избежать обезвоживания и гибели животного, на путь возбуждающего луча устанавливают затвор для предотвращения тушения флуорофоров в исследуемой ткани, а также для того, чтобы животное не было повреждено лазерным лучом; затем, как и прежде, освещают возбуждающим лучом и регистрируют флуоресцентный сигнал GFP при транс-иллюминации.

Прекуколка полностью вращается вокруг своей вертикальной оси. В процессе сбора данных вращение занимает всего одну минуту и повторяется через разные промежутки времени. Для создания серии изображений крыльев в процессе развития методом таймлапса данные можно собирать в течение как минимум шести часов со скоростью 100 изображений в час.

Крайне важно контролировать общую экспозицию света с помощью этого затвора, чтобы предотвратить повреждение или фотообесцвечивание. В данном фильме показаны изображения, полученные в интервале между стадией PrepU и возникновением реакции отвращения зрачка. При реконструкции трехмерного изображения наблюдается сильное прямое рассеяние, которое необходимо учитывать, так как его невозможно аппроксимировать с помощью диффузии.

Таким образом, для выполнения реконструкции необходимо определить модель прямого рассеяния света при распространении. Для упрощения мы пренебрегаем поглощением. Степень рассеяния проверяется экспериментально. Для этого в нефлуоресцирующую белую препупу 1118 вводится инородный объект со стандартизированной флуоресценцией, после чего проводится сканирование для получения данных прямой модели. Начните с заполнения силикажной капиллярной трубки диаметром 100 микрон флуоресцентным красителем PS 5.5.

Используя капиллярный эффект, введите капиллярную трубку в куколку под углом 45 градусов к передней оси; закрепите PrepU в капиллярной трубке и расположите ее соответствующим образом на вращающемся столике, как было описано ранее. Теперь осветите прекуколку возбуждающим лазерным лучом через линзу с малой числовой апертурой и получите изображения флуоресцентной транс-иллюминации прекуколки. Как было описано ранее, программное обеспечение MATLAB используется для подгонки данных под явную теоретическую прямую модель. Для упрощения процесса реконструкции выбрано приближение Диффузного приближения к уравнению переноса, так как оно описывает режим прямого рассеяния и соответствует экспериментальным данным.

Определив подходящую прямую модель, мы можем реконструировать слюнные железы и получить серию томографических реконструкций во времени. Если вы планируете использовать томографию в свободном пространстве, также могут быть настроены алгоритмы конфигурации для согласования показателей преломления. Сначала мы продемонстрируем 3D-реконструкцию слюнных желез на ранней стадии развития.

Для сравнения гистологическое окрашивание слюнных желез показывает, что результаты реконструкции хорошо коррелируют с данными гистологии. Данное таймлапс-видео развития имагинальных дисков крыла было получено от одного живого образца. Для сравнения гистологическое окрашивание диска крыла в те же временные точки показывает, что результаты реконструкции хорошо коррелируют с данными гистологии.

Мы только что продемонстрировали вам, как создать систему для получения изображений трехмерных структур in vivo и в динамике. Это позволяет отслеживать морфогенез у Drosophila и наблюдать за развитием крыльев на протяжении шести последовательных часов. При выполнении данной процедуры крайне важно выбрать правильную прямую модель распространения света в Drosophila.

Этот метод может быть использован в сочетании с гистологическими методами для изучения развития органов на разных стадиях развития зрачка, а также может быть модифицирован для исследования других организмов аналогичного размера. На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.